如何用流式检测小鼠外周血中T细胞的凋亡

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  guodongjia 2016-12-31 00:00:00

  中性粒细胞(PMN)是机体防御系统的主要组成部分，能吞噬和杀灭多种致病原。致病原与血清中的特异性抗体(IgG)结合后，通过IgG的Fc部分与PMN表面的受体——FcγRⅢ(CD16b)相结合，从而被吞噬。FcγRⅢ有a、b两种类型，FcγRⅢa(CD16a)是一种跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一种糖肌醇磷脂蛋白(GPI-锚蛋白)［1］。近年发现阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者在血细胞表面缺失各种特异的GPI-锚蛋白，CD16b正是这类蛋白之一。为探讨PMN表面CD16b的缺失与PMN释放氧自由基杀菌功能的关系，将我们的研究报告如下。 材料和方法 1　标本采集　正常人外周血取自协和医院血库正常献血者，正常取自协和医院胸外科手术患者的肋骨，PNH患者按1987年全国溶血性贫血会议拟定的诊断标准，并经流式细胞仪免疫荧光法检测CD59标记率进一步确诊。 2　中性粒细胞的分离　 新鲜的外周血或，用肝素抗凝，经淋巴细胞分离液分离，去除淋巴细胞和单个核细胞，用右旋糖酐(dextran，分子量=7～11 万) 沉降和低渗法去除红细胞，得到纯净的中性粒细胞。用台盼蓝染色法检查细胞活力，须保证细胞存活率大于95%。 3　间接免疫荧光法检测CD16　取1×106个细胞，悬浮于100μl 2% BSA中，室温封闭30分钟，加 CD16单克隆抗体(Immunotech SA公司产品)，在室温作用30分钟后，用PBS洗涤2次，再悬浮于100μl 2％BSA中，加FITC 标记的羊抗鼠IgG(Gibco公司产品)室温暗染20分钟后洗去二抗。用500μl PBS悬浮细胞，用流式细胞仪检测CD16 标记率。 4　中性粒细胞功能测定　 佛波醇酯(PMA，Sigma产品，用DMSO溶解，配制成1mg/ml，储存于－20℃，临用前稀释)能激活中性粒细胞，使之释放活性氧，其中O-2*和H2O2能与化学发光剂Luminol(3-氨基苯二甲酰肼，北京化工厂)反应而发光。用LKB-1250发光仪(Luminometer)检测。正常人和PNH患者中性粒细胞，制备成细胞悬液(107 /ml)与 100nmol/L PMA 反应，37℃15分钟，置于冰上终止反应，取含1×105 细胞的激活液加入到1ml 0.1nmol/L 的Luminol 溶液中，立即测定发光值，每一数值测定3次以上， 取平均值。取正常人的不同细胞数，测定发光值，结果显示发光值与细胞数有良好的线性关系，说明此方法具有可靠性 (附图)。 附图　细胞数与发光值的线性关系 5　细胞培养　以 1×106个细胞/ml的密度接种PMN于IMDM培养基(含10%自身血清)，37℃、5% CO2分别培养12，16，20小时。 6　细胞形态学观察　不同培养时间的细胞用瑞氏染色，光学显微镜下观察。 7　DNA含量分析　取细胞1×106，PBS洗2遍，以70%冷乙醇(4℃)固定12小时以上，用PBS洗去乙醇，加入0.5ml柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 7.8)室温作用5分钟，离心后以PBS重悬细胞，加入 RNaseA (终浓度60μg/ml)37℃作用30分钟，再加入碘化乙锭(PI，终浓度50μg/ml)4℃暗染30分钟，以染细胞内总DNA，用流式细胞仪分析正常细胞和凋亡细胞，计算凋亡率。

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