求助：壳聚糖纳米粒透射电镜表征的制样方法

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脂质纳米粒简介

脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle，LNP)是一种粒径介于 10-1000 nm 的新型药物递送载体，由多种有机材料、无机材料、金属 - 有机框架或这些材料组合而成，可作为化学与生物制剂之间传递的媒介，脂质纳米粒包裹药物可显著提高药物的稳定性与生物利用度。[1]目前脂质纳米粒广泛应用于mRNA疫苗递送、肿瘤治 疗、抗 炎和抗感染药物载体、治 疗神经退行性疾病、抗疟等领域。

脂质脂质纳米粒可分为固体脂质脂质纳米粒(Solid Lipid Nanoparticles，SLN)和纳米结构脂质载体(Nanostructured Lipid Carriers，NLC)。固体脂质脂质纳米粒（SLN）主要是由固体脂质、表面活性剂、有效成分和水制备的胶体颗粒，具有生物相容性好、有机溶剂使用少、体内稳定性高、应用范围广等优点。但在储藏过程中仍存在载药量低、易凝胶化和药物泄漏等问题；为此，研发人员尝试在固体脂质壁材中加入一定量的液体油脂，打乱了原来单纯固体脂质壁材的有序的晶体结构，负载活性成分的量得到了提高，也使得晶体结构更加稳定，不易发生泄露等现象。[2-3]

图1 LNP的结构[3]

脂质纳米粒靶向性研究是药物递送热点研究方向之一，考虑到纳米药物自身性质的影响，可通过对其自身物理化学性质进行调控，如粒径、表面电荷、表面修饰物等，以此来增加脂质纳米粒药物的渗透作用。目前还开发了各种粒径可调控的纳米递药系统，Li 等[4，5]构建了一种酸刺激响应型脂质纳米粒，可以在低 pH 条件下将其粒径从 100 nm 缩减到5 nm。脂质纳米粒的初始尺寸有利于长时间的血液循环，当到达肿瘤部位后，酸性环境刺激脂质纳米粒发生结构变化，粒径缩小，有助于脂质纳米粒外渗和组织渗透。除 pH 响应外，肿瘤组织处特异的酶环境、肿瘤细胞内的还原环境和光、热、磁等外部刺激都可以用于调控纳米药物的粒径和表面电荷。[5]

除平均粒径外，脂质纳米粒的尾端大颗粒和过小颗粒也会影响纳米药物的效果，尾端大颗粒容易造成脂质纳米粒聚集，影响药物的稳定性和安全性，小颗粒（＜5nm）会被直接脏快速地过滤清除，影响药物的有效性。过滤可有效减少脂质纳米粒药物中的大颗粒和杂质，提高脂质纳米粒药物的稳定性。

Alpharmaca

奥法美嘉平台提供整套的脂质纳米粒均一性和稳定性的解决方案，可用于快速评估、优化脂质纳米粒的配方和工艺：高压微射流均质机、微流控技术对脂质纳米粒进行均质乳化分散处理、Nicomp粒度分析仪分析平均粒径、AccuSizer颗粒计数器分析大粒子浓度，Lum稳定性分析仪快速分析脂质纳米粒药物稳定性，Entegris-ANOW滤芯过滤杂质及大颗粒。

脂质纳米粒的制备技术

传统的脂质纳米粒制备技术，包括乙醇注入法、薄膜分散法、逆向蒸发法、冻融法等，存在粒径分布广和批间重复性大等问题，对药物开发的临床试验和生产具有很大的影响。为了解决传统制备方法的弊端，微流控混合技术、高压微射流技术、高压均质等新型制备技术应运而生。

高压微射流制备方法：制备水相、油相，经过混合、剪切步骤形成初乳，初乳经微射流均质机均质，而后除 菌过滤得到脂质纳米粒。

微流控混合技术制备方法：制备水相、油相，将水相油相经过微流控均质乳化后，除 菌过滤得到脂质纳米粒。

无论是通过何种方法制备脂质纳米粒药物，后续都需要对其平均粒径、尾端大颗粒、稳定性进行检测来筛选配方，PSS的Nicomp粒度分析仪可用于测试平均粒径、AccuSizer颗粒计数器可用于测试大颗粒浓度、Lum稳定性分析仪可用于快速筛选在不同工艺制备下脂质纳米粒药物的稳定性。

图2 高压微射流法制备脂质纳米粒

图3 微流控混合技术法制备脂质纳米粒

脂质纳米粒的粒径控制

脂质纳米粒的粒径与其靶向性和有效性紧密相关，粒径小且分布窄是脂质纳米粒药物的理想粒径。微流控技术通过微米通道控制流体的流动和混合，具有良好的单分散性、可控性及重现性，可改善脂质纳米粒的均一性和药物包封效率，并实现高通量生产，已成功应用于Covid-19 mRNA 疫苗的制备[6]。高压微射流均质技术使物料在高压作用下以高速度流经腔体，经过剪切、碰撞、空穴效应等物理作用降低脂质纳米粒的平均粒径，可对脂质纳米粒初乳进一步均质分散。

高压微射流均质机

PSI-20高压微射流均质机（小试兼中试型）采用固定结构的均质腔，通过电液传动的增压器使物料在高压作用下以极大的速度流经交互容腔的微管通道，物料流在此过程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效应等物理作用，使得平均粒径降低、体系均一稳定，由此获得理想的均质、分散、去团聚的结果。

图4 PSI高压微射流均质机

最 高2069 bar的均质压力，最 高处理量20L/h（PSI-20）

采用特殊设计Y型腔，去除尾端大颗粒效果佳，物料的混合更均一，处理效率高。

屏显界面，数据可溯源：支持数据导出设定压力及实时压力、监测点温度、实时流量、时间等。

配置K型热电偶：可用于实施监测料液温度。

低噪音：运行音量低于70分贝，工作环境友好型。

NanoSpirit 系列微流控药物制剂递送平台

微流控制备系统通过制造泵和高压输送泵与微流控芯片连接。A相和B相可以按一定比例以恒定速度混合和乳化。在微流控芯片中，设计不同的流道结构，控制不同的速度，使样品在微流控芯片中湍流、层流或雾化，可以满足预乳化或再乳化的要求。还可以将制备好的样品通过高压泵输送到高压微流控芯片中，通过冲击力和剪切力控制粒径，达到达到所需的包封率、粒径、粒径分布均一性等要求。

图5 NanoSpirit 系列

高精度流量控制（＜5‰）。

可提供多项可调参数（ 反应量、流速等）。

多型号微流芯片通用，适合多种载体类型。

注射器规格：0.25，1，2.5，5，10 ml。

自动充液、反应、前后排废、清洗等工能

平均粒径与Zeta电位检测

脂质纳米粒径不同使药物富集在不同部位可现不同治 疗 效果。应用于肿瘤治 疗领域的脂质纳米粒，由于肿瘤组织处血管丰富，血管壁间隙较宽且结构完整性差，具有适宜尺寸的脂质纳米粒（60-200 nm）可通过 EPR 效应在肿瘤处积聚，实现纳米药物的被动靶向。

脂质纳米粒电性一般呈中性或轻微负电性，在血液循环中，高正电性的脂质纳米粒会吸附蛋白质，被迅速清除，进而影响脂质纳米粒的药代动力学和生物分布。相比之下，中性脂质纳米粒以及带有轻微负电荷的脂质纳米粒则显示出延长的半衰期。Zeta电位是衡量药物稳定性指标之一，Zeta电位的绝 对值越高，体系越稳定。

Nicomp纳米激光粒度仪系列

Nicomp系列纳米激光粒度仪采用动态光散射原理检测分析样品的粒度分布，基于多普勒电泳光散射原理检测ZETA电位。

图6  Nicomp 3000系列

粒径检测范围0.3nm-10μm，ZETA电位检测范围为+/-500mV

搭载Nicomp多峰算法，可以实时切换成多峰分布观察各部分的粒径。

高分辨率的纳米检测，Nicomp纳米激光粒度仪对于小于10nm的粒子仍然显示较好的分辨率和准确度。

图7  高斯粒径分布图                      图8  多峰粒径分布图

颗粒分布检测

尾端大颗粒的存在会影响药物本身的稳定性，由于表面积增大，使得体系形成热力学不稳定体系，容易发生脂质纳米粒聚集以降低体系自由能现象。尾端大颗粒的存在还会对身体机能造成影响，较大的颗粒（> 200 nm）容易积聚在肝脏和脾 脏中，影响药物安全性；粒径极小（< 5 nm）的颗粒则会被肾脏快速地过滤清除，影响药物的有效性。

AccuSizer颗粒计数器系列

AccuSizer系列在检测液体中颗粒数量的同时精确检测颗粒的粒度及粒度分布，通过搭配不同传感器、进样器，适配不同的样本的测试需求，能快速而准确地测量颗粒粒径以及颗粒数量/浓度。

图9 AccuSizer系列

检测范围为0.5μm-400μm（可将下限拓展至0.15μm）。

0.01μm的超高分辨率，AccuSizer系列具有1024个数据通道，能反映复杂样品的细微差异，为研发及品控保驾护航。

灵敏度高达10PPT级别，即使只有微量的颗粒通过传感器，也可以精 准检测出来。

可出具法规报告

LumiSpoc单粒子颗粒计数器

LumiSpoc采用单粒子光散射技术（SPLS），通过在光学流通池中进行流体动力聚焦，将单个粒子排列成一条直线。通过调整流动条件来调整样品浓度，从而避免浓度峰值的影响。当单个纳米或者微米颗粒经过特殊光束截面的激光束时，记录其正向和侧向散射的光强。根据米氏理论，将分类强度转换为粒度分布密度。通过软件分析显示计数分布、颗粒浓度。在行业内已有使用Lumispoc用于颗粒浓度的监测成功案例。

图10 LumiSpoc单粒子颗粒计数器

颗粒粒径检测范围：50 nm ~ 8 µm（取决于样品）

颗粒浓度检测范围：1 × 106 ml-1 ~ 1 × 109 ml-1

进样体积：250 μl

稳定性分析检测

稳定性是评价药物制剂质量的重要指标之一，也是确定药物制剂使用期限的主要依据。药物制剂若发生分解、变质，可导致药效降低，甚至产生或增加毒副作用，危及患者的身体健康和生命安全，Zeta电位、尾端大颗粒浓度都是衡量药物稳定性的指标之一。除此之外，还可以使用稳定性分析仪测量样品的分离、沉降、悬浮或澄清、浮离、聚集、凝聚或产品存放期以及粒径分布。

LUM稳定性分析仪

Lum稳定性分析仪可以直接测量整个样品的分散体的稳定性，检测和区分各种不稳定现象，如上浮、絮凝、聚集、聚结、沉降等，通过测量结果可用来开发新的配方和优化现有的配方及工艺。

图11 LUM稳定性分析仪

快速、直接测试稳定性，无需稀释，温度范围宽广

可同时测8个样品，测量及辨别不同的不稳定现象及不稳定性指数

加速离心，最高等效2300倍重力加速度

过滤

经高压微射流均质机或微流控技术处理的脂质纳米粒，还需进行适当的过滤工艺，用于去除脂质纳米粒药物中的尾端大颗粒和杂质，提高药物的稳定性和安全性。滤膜的材质和型号将影响脂质纳米粒药物的过滤效率和效果，综合考虑膜与纳米药物配方的兼容性、成本、效率等多方面因素选择合适的滤膜。

Entegris滤芯

Entegris-Anow是一家高分子微孔膜过滤企业，专业从事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等（膜孔径为0.03μm~10μm）微孔膜的研发及生产，具有二十多年服务与医药客户经验，并为全 球生物制药、医疗器械、食品饮料、实验室分析、微电子及工业等领域的客户提供过滤、分离和净化解决方案。

在我们使用微流控或其他方法合成核酸脂质纳米粒后，成品溶液常常因有机溶剂的存在而不稳定。以常见的微流控水相、有机相合成比3:1为例，有机相溶剂常使用无水乙醇，在混合后仍然有高达25%的含量。高浓度的乙醇将逐渐破坏溶液中的纳米粒子，使其粒径逐渐增大。有的甚至能在短短数小时内由50 nm增长到200 nm，严重影响实验结果和方案评估，所以合理、及时的后处理尤为重要。通常而言，后处理等同于除溶剂，但一般也会对溶液中的纳米粒子进行粒径测定。 粒径测定通常使用动态光散射粒度仪，需要注意的是，不同品牌的粒度仪对于同一个样品的检测结果会有些许差别。另外，在检测过程中，需要注意待测液体的浓度和温度对结果造成的影响：一般而言，浓度过高的液体因散射光被大量粒子阻挡，所测出的粒径偏差较大；而温度决定了粒子布朗运动强度，溶液温度没有平衡前也会影响粒径的检测结果。 除溶剂则通常采用超滤或透析。超滤为主动式，速度快；透析为被动式，速度慢。有些科研工作者可能会担心超滤的方式过于猛烈，导致纳米粒子的破坏。对于这一点其实没有必要过于担心，一方面在超滤的过程中，并不会完全将溶剂去除——通常在剩1 – 2 mL时就停止离心；另一方面超滤相对于透析更快，虽有极少量的纳米粒子破坏，却避免了有机溶剂长期留存带来的影响，两害取其轻，超滤仍旧是除溶剂的有效办法。

超滤管

  测粒径和除溶剂的具体步骤如下：

1. 完成纳米粒子的合成后（假定成品1 mL），立刻用去钙去镁的D-PBS进行40倍稀释，体积为40 mL。稀释后取0.5 – 1 mL左右进行粒径测定，剩余39 – 39.5 mL执行剩余步骤以除溶剂。2. 将剩余溶液倒入超滤管中，室温（20℃）下以2000×g的速度离心5 – 30 min，离心时间依超滤管孔径大小而有所区别，第一次尝试时可以密切关注超滤管中的液体，以剩余1 – 2 mL为停止信号。3. 取出超滤管，将下方液体倒出，在超滤管上方继续添加剩余溶液（如果步骤2没有完全倒入超滤管中的话），并用移液枪吸取管中液体冲洗滤膜数次，按步骤2的参数再次超滤。4. 重复步骤2 – 3，直至溶液全部浓缩至1 mL左右。用移液枪吸取管中液体冲洗滤膜数次后将液体全部吸出转移并在生物安全柜中过0.2 μm滤膜除菌（如不进行生物实验则无需除菌）后，即为最终品。得到最终品后，就可根据使用者的实际需求稀释成相应浓度，并进行动物或细胞实验。

随着纳米技术的不断发展，纳米药物在医药领域的应用越来越广泛，尤其在疫苗的研发、基因治疗，肿瘤靶向等方面显现了不可替代的优势。锘海生物为科研工作者和企业提供全面的纳米药物制备、生产及检测服务，囊括了纳米药物研发过程中，从处方筛选到制剂表征的全线过程。为客户简化流程，节约时间成本，同时提供高质量的数据分析与技术支持服务。 

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点击以下链接，查看往期回顾

核酸脂质纳米粒（LNP）科普 —— 组成成分及作用

核酸脂质纳米粒科普——氮磷比计算

通过微流控技术高效、可放大的制备核酸脂质纳米粒

mRNA-LNP的结构到底是怎样的？

大小、结构不同的mRNA-LNP，细胞内的蛋白表达会不同吗？—— 粒径大小篇

mRNA体内递送载体有哪些？

NanoAssemblr制备的LNP实现对CRISPR-Cas9的高效递送

在上一期的核酸脂质纳米粒主题文章中，我们列举了后处理的步骤及细节，其中一项关键内容——超滤除溶剂——使用的就是市面上较为常见的超滤管。但看似相同的超滤管实际上有多种规格，通常以相对分子质量（Dal或kD）来标示，如10 kD、50 kD、100 kD等。数字越大，代表了滤膜的孔径越大，截留下来的物质分子量也相应更大。

在我们销售微流控仪器时，就经常会接到客户的提问：究竟多少规格的超滤管适合自己制作的核酸脂质纳米粒呢？同时，我们也发现，尽管有些客户包裹的是相似长度的核酸，使用的超滤管规格却完全不同。因此在这篇文章中，我们将通过计算来确定使用的超滤管规格。

一般而言，为了保证我们需要的物质能够几乎完全被截留，选用的规格大小在目标物质的分子量的1/3甚至1/4较为合适（这是在蛋白组学、生物化学等领域的一个经验值，也可根据实际产物进行调整）。规格过大会导致大部分目标产物流失；规格过小则会导致超滤时间急剧增大，这对于在有机溶剂中不稳定的核酸脂质纳米粒而言是致命的。

确定了规格大小和目标物质分子量之间的比例后，下一步需要确定目标物质的相对分子质量。在这里，首先需要明确相对分子质量（Mr）单位Dal与物质的摩尔质量（M）单位g/mol之间的关系。相对分子质量是该分子的质量与“一个12C原子质量的1/12”的比值；摩尔质量则是单位物质的量的物质所具有的质量——看似非常绕，但实际上两者的数值是相等的。例如胆固醇的摩尔质量为386.65 g/mol，而一个胆固醇分子的相对分子质量也为386.65 Dal，其中不同就是摩尔质量是一个宏观整体的概念，而相对分子质量则需要确定对象的具体情况，对于核酸而言就是要确认组成核酸的碱基数量。在氮磷比计算一文中，我们提到碱基的平均摩尔质量为330 g/mol，所以一个碱基的相对分子质量为330 Dal。

假设我们的mRNA具有n个碱基，则其相对分子质量为330n Dal，如果我们希望这个值为超滤管规格的3倍，则意味着超滤管的规格不得大于110n Dal，由此我们就可以得到下方一个简单的表格。

由此我们可以看到，其关系直接明了。在实际使用过程中，超滤管通常不会超过100 kD，因此，只要我们的核酸碱基超过909个，便可以使用100 kD的超滤管。当然，为了保险起见，也可以使用50 kD超滤管。需要注意的是，以上均以mRNA为例。如果为短链siRNA，通常在一个纳米粒中会有多个的siRNA链，因而在计算的时候要乘以相对应的数量。

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实验室制样研磨机        来源：盛科仪器 | 作者：盛科仪器 | 时间：2019-07-10

一、用途：

适用于快速有效而无损地将中硬性、硬性、脆性和纤维状物质细磨至分析要求的细度，广泛应用于建材行业、水泥行业、钢铁冶金行业、地质矿物行业、有色金属行业、电厂及科研等行业，因其出样的速度和细度，能应用于XRF射线荧光光谱仪分析的样品制备。

二、主要优点

1.制粉粒度均匀细微，可直接用于分析化验。.

2.粉碎机构和整机结构全采用密封设计，无料样损失，无粉尘污染。

3.偏心组件与电机轴分离式结构，提高电机的寿命。

4.磨盘快速紧固装置，压紧一步到位，一键式启动运行试验，方便快捷。

5.研磨室内空间封闭隔音，内部采用GX隔音棉，有效降低噪声。

6.强劲的偏心振动机构，带来的研磨作用力，使研磨时间极短，效果好。

7.设备防护门采用气动杆支撑，防护门处安装限位开关，防护门打开即自动断电，保障使用安全。

8.粉碎装置有耐磨合金钢、高锰钢、氧化钢、钢玉、玛瑙、碳化钨多种材质，可供客户选购。

ICP-OES（感应耦合等离子体光谱发射光谱）技术是一种广泛应用于元素分析的高效方法，常用于环境、食品、化学、冶金等领域的分析检测。其核心优势在于能够同时分析多种元素，具有较高的灵敏度和准确度。要使得ICP-OES能够获得准确可靠的测试结果，合适的样品制备是至关重要的步骤。本文将详细探讨ICP-OES样品制备的基本方法和注意事项，帮助实验人员在实际操作中提高测量的精度和效率。

在进行ICP-OES分析之前，首先要对样品进行适当的制备，以确保分析结果的准确性。ICP-OES分析需要液态样品，这就要求原始样品通过一系列的步骤转化为溶液形式。常见的样品制备方法包括酸溶解、稀释以及特殊样品的预处理。

样品溶解是ICP-OES样品制备中基本的步骤。许多固态样品（如矿石、土壤、金属等）通常通过强酸处理进行溶解，常用的酸包括硝酸、氯酸、氟酸等。针对不同的样品，选择适当的酸和溶解条件是确保样品完全溶解并避免某些元素损失的关键。例如，硝酸用于大多数金属和矿石的溶解，而氟酸则用于硅酸盐矿物的溶解。在这一过程中，酸的浓度、温度以及加热时间的控制都直接影响到样品溶解的效果。

在溶解后，样品可能会存在一些不溶物或杂质，这时需要对溶液进行过滤或离心处理，以去除悬浮物。经过溶解和过滤的溶液，通常还需要根据ICP-OES仪器的要求进行稀释。稀释是为了确保样品中待测元素的浓度在仪器的量程范围内，避免因为过高的浓度导致光谱信号饱和，影响测量结果的准确性。

某些复杂样品（如生物样品、食品样品等）可能含有有机物质或脂肪等成分，这些成分可能干扰ICP-OES的分析。在这种情况下，可能需要进行额外的预处理，如湿法消解（即通过酸和加热将有机物完全分解），以确保样品中的干扰物被有效去除，保证ICP-OES的分析结果不受影响。

值得注意的是，样品的溶解速度与所用溶剂的种类密切相关。有些溶剂可能由于化学反应或过强的酸性而损害仪器，因此，选择合适的溶剂和操作条件至关重要。对于极其难溶的样品，可以考虑采用微波消解技术，通过高温高压环境加速样品溶解过程，这种方法能够显著提高溶解效率和准确性。

在样品溶解并准备好进行ICP-OES分析后，操作人员应确保溶液的均匀性，避免因溶液中元素浓度不均而导致分析结果偏差。在制样过程中要严格按照标准操作规程（SOP）进行，以确保制样的一致性和可靠性。

ICP-OES样品的制备过程虽然繁琐，但其对分析结果的准确性至关重要。通过科学合理的样品前处理，可以有效提高ICP-OES分析的灵敏度和准确度。操作人员在实际工作中需要根据不同样品的性质选择合适的制样方法，确保样品的稳定性和一致性，从而为ICP-OES的成功分析奠定坚实基础。

拉力试验机在材料测试和工程应用中扮演着至关重要的角色。要获得准确的测试结果，制样环节显得尤为重要。本篇文章将深入探讨拉力试验机的制样流程，提供详细的步骤和注意事项，帮助您理解如何通过正确的制样方法来确保测试的可靠性和准确性。

在进行拉力试验机测试之前，首先需要选择合适的试样材料。试样的形状和尺寸需遵循相关标准，这样才能确保测试结果的可比性。标准化的试样通常为平行板或狗骨形状，具体选择依赖于正在测试的材料种类和相关行业标准。按照标准要求，试样应无明显的缺陷，如气泡、划痕等，以避免对测试结果产生负面影响。

制样过程中，切割设备需保持良好的锋利度，以确保切割边缘平滑。在切割过程中，避免过大的温度变化，这可能导致材料特性失真。要进行试样的表面处理，特别是在金属材料的情况下，去除氧化层和油污可以有效提高接触面的质量，进而提升测试精度。

在制样完成后，试样的标记同样重要。每个试样应清晰标注，以便于在后续的测试和数据分析中，能够准确追溯每个试样的来源和测试条件。试样应妥善存放，避免潮湿和污染，以保持其物理特性在测试前的稳定性。

拉力试验机的制样过程至关重要，正确的制样步骤将为材料测试提供有力保障，确保结果的可靠性和准确性。在材料测试领域，专业的制样方法是实现高质量测试结果的基础。