在缺氧条件下可不可以进行细胞培养？

　　该应用描述了一种在流动下的粘附试验，该试验旨在研究特定细胞表面分子的作用，以确定它们在细胞附着和粘附到其他细胞类型期间的潜在相互作用。

　　对于我们的方法，我们使用预染色的鼠肿瘤细胞（多发性骨s瘤：MM）和鼠内皮细胞（EC），然后使用单克隆抗体阻断我们感兴趣的分子之一。简而言之，将EC接种到ibidi通道μ-SlidesI0.6mmLuer中，并在恒流下培养24小时。为了开始共培养，将标记的MM细胞添加到流动容器中并继续流动。24小时后，用抗体（以阻断感兴趣的分子）或相应的同种型对照处理装置，并保持流动24小时。第二天，将μ-Slides与流体单元(FU)断开并清洗以去除非粘附的MM细胞。为了分析标记的MM细胞对EC的粘附，使用共聚焦显微镜获得了μ-Slides的荧光图像。

　　1. 材料和试剂

　　•MOPC多发性骨s瘤(MM)细胞系(ATCC,TIB-23™)

　　•EOMA内皮细胞(EC)系(ATCC,CRL-2586™)

　　•含10%FCS的RPMI培养基（FisherScientific，11530586）

　　•内皮细胞生长培养基（EC培养基、CellBiologics、M1168）

　　•PBS（泛生物技术，P04-361000）

　　•非酶细胞解离溶液（Sigma-Aldrich，C5914-100ML）

　　•台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，93595）

　　•CellTracker™绿色CMFDA染料（ThermoFisher，C7025）

　　2. 设备和设置

　　•带有2个流体单元(FU)的ibidi泵系统，每个单元都带有用于2ml储液罐的支架（ibidi，10977）

　　•ibidiμ-SlideI0.6mmLuer，ibiTreat（ibidi，80186）

　　•ibidiPerfusionSet蓝色，15厘米，内径0.8毫米（ibidi，10961）

　　•ibidi过滤器/储液罐套装，2毫升（ibidi，10972）

　　•带细胞培养设备的层流罩

　　•培养箱（所有培养步骤均在37°C和5%CO2下进行）

　　•带有适当滤光片组和照相机的荧光显微镜

　　•粘度：0.0072(dynxs)/cm²

　　3.实验流程

　　1.准备EOMA细胞稀释液：根据制造商的说明，使用非酶细胞解离溶液分离先前培养的EOMA细胞。使用血细胞计数器（Neubauerchamber）对细胞进行计数。在EC培养基中将细胞稀释至1.2x106个细胞/ml的浓度。

　　2.种入EOMA细胞：在3个 µ-SlidesI0.6mmLuer（ibidi，80186）中加入150µlEOMA细胞稀释液（每个µ-Slide1.75x105EOMA细胞），然后孵育3小时。

表1：实验设置

　　3.启动流量：播种三小时后，将2个µ-Slides连接到流体单元FU，使用总量2.7毫升EC培养基。在8.2mbar的压力下将EOMA细胞表面的剪切应力设置为0.5dyn/cm²。测量流速并使用两个FU的平均值来计算校准因子。提前孵育FU和连接的载玻片过夜。第三个带有EOMA细胞的µ-Slide用作静态控制。在没有任何流动的情况下孵育它过夜。

　　4.准备MM细胞：根据制造商的方案，用CellTrackerGreen(CMFDA)染料在600µlRPMI培养基（不含FCS）中染色6x105MM细胞。标记后，离心细胞并使用血细胞计数器对其进行计数。

　　5.开始与MM细胞共培养：停止流动并在无菌条件下从FU水库中取出EC培养基。要开始共培养，将RPMI培养基（含10%FCS）和EC培养基以1:1的比例混合，并填充该混合物总体积为2.5ml，其中含有1.5x105MM注入两个FU储液罐。将FU重新连接到泵系统并继续流动24小时。

　　6.分子阻断：将MM细胞添加到ECs后24小时，用100µg/ml抗体（载玻片 #2）或相应的同种型对照（载玻片 #1）处理细胞，将它们直接添加到FU，无需更换介质。将孵育保持在流动状态下24小时。

　　7.清洗和成像：从FU上断开µ-Slides。用PBS清洗细胞一次，以去除任何非贴壁细胞。使用共聚焦显微镜获取荧光图像，以可视化附着在EC层上的标记MM细胞。

图1：与同种型对照处理（左图）相比，阻断特定表面分子（右图）时，MM细胞对ECs的粘附性降低