用于片上生物工厂的基于液滴微流控的集成分散相显微镜

2% surfactants表面活性剂FluoSurf
In the droplet generation unit, highly monodisperse droplets encapsulating H. lacustris cells are generated on demand. The buffer with suspended H. lacustris cells and biocompatible fluorescence oil (HFE-7500) with 2% surfactants (FluoSurf, Emulseo) are employed as the dispersed phase and the continuous phase, respectively.

用于片上生物工厂的基于液滴微流控的集成分散相显微镜
在代谢工程中，对单细胞胞内结构的生物分子成像以及随后的细胞筛选有很高的要求，以开发具有所需表型的菌株。 然而，当前方法的能力仅限于群体规模的细胞表型鉴定。 为了应对这一挑战，我们建议利用分散相显微镜与基于液滴的微流体系统相结合，该系统结合了液滴按需生成、生物分子成像和液滴按需分选，以实现细胞的高通量筛选 已识别的表型。 特别是，细胞被封装在形成微流体液滴的均质环境中，并且可以研究生物分子诱导的分散相以指示单个细胞中特定代谢物的生物量。 因此，检索到的生物量信息引导片上液滴分选单元筛选具有所需表型的细胞。 为了证明概念，我们通过促进湖红球藻菌株向高产天然抗氧化剂虾青素的进化来展示该方法。 所提出的系统具有片上单细胞成像和液滴操作功能的验证揭示了高通量单细胞表型分析和选择潜力，适用于许多其他生物工厂场景，例如生物燃料生产、细胞治疗中的关键质量属性控制等。

本内容节选自下面文献：

Yingdong Luo, Yuanyuan Huang, Yani Li, Xiudong Duan, Yongguang Jiang, Cong Wang,  Jiakun Fang,* Lei Xi,*  Nam-Trung Nguyen  and  Chaolong Song, Dispersive phase microscopy incorporated with droplet-based microfluidics for biofactory-on-a-chip, Lab Chip, 2023,23, 2766-2777. DOI: 10.1039/D3LC00127J

微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了微流控液滴的动态分析部分如速度场、表面活性剂等知识。

细胞是生物结构和功能的基本单元，在类型和状态上有很大差异。在大多数生物系统中，我们对细胞多样性的认识是不完整的，就像神经系统（脑细胞）这样的复杂组织[1]。单细胞识别和功能的表征，作为对每个细胞的功能和反应的理解，将加速生物领域的发现。它可能是癌症、肿瘤，几何任何可能在细胞群中具有多样性的东西。然而，今天的技术并不能提供一种简单的方法来同时分析大量的单个细胞。快速、可扩展的液滴测序（Drop-Seq）这种方法可以用来表征具有许多细胞类型和状态的复杂组织。

Drop-Seq的原理和好处
Drop-Seq是一种基于使用微流体技术的方法，通过将它们封装在微小液滴中进行平行分析，可以快速分析数千个单个细胞。

这些纳升级水性隔离室已用于微流体器件中的许多应用：纳米颗粒制造、乳液和泡沫、药物输送，但也作为PCR和逆转录的微小反应室[3]。Drop-Seq使用液滴将细胞分隔成纳升大小的反应室，用于分析其mRNA转录物，同时使用分子条形码策略记住转录物的起源细胞。通过这种技术，一个科学家每天可以制作10000个单细胞库，实验并行进行且简单。因此，该方法将允许为已知细胞类别和新的候选细胞亚型产生基因表达的分子图谱。

Drop-Seq利用微流体的优势

（1）很短的时间内有很高的吞吐量

（2）尽量减少昂贵样品的消耗

Drop-Seq包含以下步骤

1. 从组织中制备单细胞悬浮液
2. 准备条形码引物（或者在微颗粒表面或者在内部）
3. 使用微流体装置将每个细胞单独地与一个微小条纹的微粒共同包覆或封装在一个微小的液滴中
4. 一旦分离成液滴，裂解细胞，释放它们的mRNA，然后与引物（primers）杂交。
5. 打破液滴并产生STAMP（附着于微粒的单细胞转录组）
6. 放大STAMP
7. 测试和分析：使用STAMP条形码推断每个转录物的起源细胞

Drop-Seq可以使用2种beads：
A：“简单”的微粒
B：水凝胶微粒

该项工作的ZD是“简单”微粒的使用，并简要介绍了水凝胶微粒，其原理保持不变。

Drop-Seq使用简单的微粒
1. 从复杂的组织中准备单细胞悬浮液
将复杂组织解离成单个细胞

2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每个微粒包含超过108个单独的引物，它们共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“细胞条形码（cell barcode）”，但具有不同的独特分子标识符（UMI）。事实上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，这允许在STAMP形成后进行PCR扩增。细胞条形码，仅在相同微粒的所有引物上相同但与其他beads上的细胞条形码不同，允许回复细胞的起源。每种引物上不同的UMI允许对mRNA转录物进行数字计数并鉴定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕获mRNA并引发逆转录。

细胞条形码的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
为了产生细胞条形码，将微粒库重复分成四个大小相等的寡核苷酸合成反应，向其中加入四个DNA碱基中的一个。然后，在每个循环后将微粒合并在一起，并进行总共12次分裂-池循环（split-pool cycles）。结果是一个微粒库，每个微粒具有4^12（16,777,216）个可能的DNA碱基序列之一。[4]

合成独特的分子标识符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循环完成后进行。将所有微粒一起进行八轮简并合成，每个循环期间可获得所有四种DNA碱基，使得每个单独的引物接受4^8（65,536）种可能序列（UMI）中的一种。[5]

3. 微流体装置
一旦单细胞悬浮液和微粒准备就绪，使用定制设计的微流体装置将单个细胞与微粒一起包覆在液滴中。

Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton

该装置在它们分成离散的液滴之前连接两路水相。层流防止在液滴形成之前混合两种水相输入，一路流相包含细胞，另一路流相包含悬浮在裂解缓冲液中的条形码引物beads。

微流体装置
组件列表
（1）倒置显微镜
（2）压力控制器+3流量传感器/三个注射泵
（3）3个falcon管/3mL注射器
（4）磁力搅拌系统
（5）用于实验装置元件连接的微流体导管
（6）微流体配件和连接器
（7）PDMS共流微流体液滴生成装置
（8）用于beads的100微米细胞过滤器
（9）用于细胞的40微米细胞过滤器
（10）计数室

实验装置连接示意图

4. 细胞裂解和RNA杂交
在液滴形成后，立即将每个细胞在液滴内裂解并释放其mRNA。然后，它们与其伴随的微粒表面上的引物杂交。

5. STAMPS产生
为了一次有效地产生数千个STAMP，通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并收集和洗涤微粒。然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成一组称为“附着于微粒的单细胞转录组（STAMPs）”的beads[6]。

6. STAMPS的放大
然后可以通过PCR反应在池（pools）中扩增条形码化的STAMP，用于高通量mRNA测序，以分析任何所需数量的单个细胞。

7. 测序和分析
使用高容量平行测序对每个末端对得到的分子进行测序。首先，将读数与参考基因组比对以鉴定cDNA的起源基因。接下来，通过细胞条形码组织读数，并且对每个细胞中确定的每个基因的mRNA转录物的数量进行数字计数。这是UMI发挥作用的地方，避免从同一mRNA转录物中重复计数序列读数。随后，可以建立数字基因表达测量矩阵（每个细胞每个基因一个测量）用于进一步的分析。

使用水凝胶微球的Drop-Seq测序
关于水凝胶beads的使用，操作原理或多或少与以上保持相同，即Z大的区别在于引物（primers），它们位于微粒内而不是位于它们的表面上。

为此，微流体装置由三个通道而不是两个通道组成：
（1）带beads的一个通道（Z关键的部分）
（2）把细胞带入液滴的一个通道
（3）带来我们需要进行分析的化学试剂的一个通道

至于“简单微粒（simple microparticles）”的使用，水凝胶beads含有可用于逆转录反应的引物，然后随后对液滴内的细胞内容物进行条形码编码，由此获得作为RNA序列的拷贝的DNA序列的集合，并且现在通过它们来自哪一个液滴来对这些序列进行分类。

然后，可以打破液滴并将整个细胞群作为大量样品处理，知道每个细胞已被单独编码。

相关的资源
开源链接：McCarroll Lab

液滴测序：Droplet-Sequencing

参考论文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。基于液滴的微流控技术可应用于单孢子或细菌类的包裹实验应用。本次网络课堂主要介绍了单孢子包裹/封装液滴用于致病真菌的研究。

应用领域：农业植物病理学、杀菌剂的发现与设计、杀菌剂筛选、杀菌剂的抗性和敏感性及分子-植物相互作用等

利用微流控技术在微流控芯片通道内进行实时的细胞培养对很多生物学、医学等领域的工作人员来讲是一个重大的挑战和机会，通过该技术可以大规模的降低实验耗材消耗，提高实验转化效率，模拟实际生物环境下的细胞生长行为等。在科学研究和工业应用中，活细胞成像的细胞培养都具有较大的应用前途，那么现在有没有一款或一套合适的仪器来做细胞培养实验呢？答案是有的，Elveflow微流控灌注套装（Perfusion Pack）结合ALine公司的Microslides便可以完成细胞培养实验。

Elveflow微流控OB1压力控制器的详细介绍：Elveflow微流控压力泵/压力控制器OB1（四通道）简要介绍

更加详细的内容介绍，请查看如下链接：http://blog.sina.com.cn/fangdzxx

也可以随时关注我们的微信公众号：信号测量与微流控系统

利用微流控技术在微流控芯片通道内进行实时的细胞培养对很多生物学、医学等领域的工作人员来讲是一个重大的挑战和机会，通过该技术可以大规模的降低实验耗材消耗，提高实验转化效率，模拟实际生物环境下的细胞生长行为等。在科学研究和工业应用中，活细胞成像的细胞培养都具有较大的应用前途，那么现在有没有一款或一套合适的仪器来做细胞培养实验呢？答案是有的，Elveflow微流控灌注套装（Perfusion Pack）结合ALine公司的Microslides便可以完成细胞培养实验。

ADHERENT MAMMALIAN CELLS

YEASTS

WORM EMBRYOS

微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了液滴微流控的发展历程、微液滴产生方式、液滴微流控的应用领域、液滴产生的实验装置、双乳液滴产生实验等知识。

（1）立即制备微流体液滴
         打开箱子，连接装置，产生液滴。
（2）可再现的高单分散性
         产生标准分散度＜2%的液滴
（3）适用于多种应用实验
         聚合物颗粒，包裹/封装，微乳液等等

凭借该微流控液滴套装，您可以随时进行液滴产生实验并获得稳定的高单分散性液滴。

基于Z畅销的多通道OB1流量控制器，微流控液滴套装包含了研究人员从开箱即用的开始产生液滴和乳液所需的全部组件。微流控液滴为微流控技术带来了诸多优势如出色的单分散性、可重复性和可扩展性。

特色
微流控液滴套装使用2通道的流量控制器OB1中的一个通道泵送分散相流体，使用第二通道泵送连续相流体，从而使两相流体进入到微流体芯片通道内，利用微流体芯片内部的微结构形成油包水（W/O）或水包油（O/W）液滴。液滴尺寸由微流体芯片通道尺寸和两相的流速比决定。借助液体流量传感器MFS或者BFS，可以测量流体通路上的液体流量，或者利用闭环反馈功能，实现液体流量的恒定控制，将稳定的两相液体流量输送入微流体芯片内。

通过向微流控液滴套装中添加额外的压力通道和特定的微流体芯片，还可以进行高级的液滴实验，例如产生两种试剂的液滴、双乳液滴、聚合物胶囊等。

为什么利用微流控技术产生微液滴？
微流控技术对液滴尺寸可控及可重复性的产生，这是任何其他技术都无法实现的。恒定的液滴芯片结构尺寸和液体流速可产生单分散性小于2%的乳液滴。

此外，微流体技术是处理超小体积并控制进入每个液滴内的物质的理想技术。微流体技术可使您轻松灵活地产生具有相同含量的相同液滴或产生具有独特有效载荷的单个液滴。

配置您的液滴产生套装
1、为您的应用选择合适的微流体芯片
     我们提供各种尺寸、规格和材料的芯片。

2、选择合适的储液池大小
     您是在处理小样品，还是正在研究生产100× mL的乳液？我们提供了与OB1流量控制器兼容的各种储液池，从1.5mL的Eppendorf管到100mL的玻璃瓶。
 

3、油和表面活性剂
     为了产生wan美而稳定的液滴，我们还提供了多种油和表面活性剂。

对液滴细胞生物学感兴趣吗？
您是否要进行Drop-Seq液滴测序实验？细菌在液滴内生长？细胞包裹？您可以随时联系我们，以获取适合您应用需求的专用单细胞套装。

微液滴应用
（1）简单乳液滴
（2）双乳液滴
（3）水凝胶
（4）泡沫
（5）聚合物合成
（6）API封装
（7）药物输送
（8）纳米粒子
（9）单细胞包裹
（10）液滴测序Drop-Seq
（11）细胞培养
   

包含的组件
标准微流控液滴套装包含以下内容：
（1）2通道的流量控制器OB1
（2）2个液体流量传感器MFS或BFS
（3）1个微流控液滴芯片
（4）2个储液池
（5）所有必需的附件：导管、连接器、过滤器等
（6）1小瓶液滴生成油
（7）图形操作软件ESI（无限制的免费下载）
（8）用户指南包含液滴尺寸图，可让您选择合适的液体流速以获得所需要的液滴尺寸。

可升级选项：
（1）额外的流量控制通道OB1
（2）额外的流量传感器
（3）电脑
（4）显微镜和相机

微流体技术的主要优势可以应用于许多的液滴应用，因此，可以调整微流控液滴套装里的组件以适应您的特定需求。

相关应用

• Researchers’opinion on droplet generation in microfluidics: syringe pumps or pressure control ? [Review]

• Generate droplets in microfluidics capillary [Application Note]

• Droplet Sequencing (Drop-Seq) [Review]

• Microfluidic flow focusing droplet generation [Application Note]

• How to perform microfluidic droplets on demand [Application Note]

• How to perform microfluidic droplets with droplet generation pack [Application Note]

• Detection of fluorescent droplets using Optoreader

参考文献

High-Throughput Step Emulsification for the Production of Functional Materials Using a Glass Microfluidic Device

Macromolecular Journals, D. Weitz et al.

Controllable generation and encapsulation of alginate fibers using droplet-based microfluidics

Lab on a Chip, Nov 2015, A. J. deMello et al.

Image-based closed-loop feedback for highly mono-dispersed microdroplet production

Scientific Reports, Sept 2017, G. Whyte et al.

Negative Pressure Induced Droplet Generation in a Microfluidic Flow-focusing Device 

Analytical Chemistry, Feb 2017, Say Hwa Tan et al