Elisa方法中的竞争法与夹心法的区别

　　ELISA实验中不同样本的处理方法你知道吗?

　　近日，东华大学一位学生生在我司购买了elisa试剂盒，并在电话中咨询了ELISA试剂盒所需要样本处理及要求。为了让更多的人了解，我司特在此为您做出如下分析：

　　关于血清：

　　室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。在血浆上，应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右 (2000-3000转/分)去除颗粒。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 尿液则用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

　　细胞培养上清

　　检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清 。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

　　组织标本

　　切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

　　注意：标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.。不能检测含NaN3的样品，因NaN3YZ辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

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　　ELISA试剂盒中常用的方法类型!

　　ELISA是Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay的简称，即酶联免疫吸附测定，是研究蛋白抗体的重要方法。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶进行直接或间接结合，然后通过酶与底物产生颜色反应，进行定性和定量分析。我们一起聊聊常见的商业化ELISA试剂盒的方法种类以及它们各自的优势和用途：

　　ELISA大致分为五种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法、捕获包被法。在商品化试剂盒中用得比较多的是双抗体夹心法、竞争法和间接法。

　　双抗体夹心法是夹心法中的一种主要形式，我们先谈谈夹心法吧：

　　夹心法(Sandwich ELISA)分为双抗体夹心法和双抗原夹心法：

　　双抗体夹心法中抗原的2个不同的抗原表位被两个抗体-捕捉抗体和检测抗体，分别结合。捕捉抗体固定于载体即酶标板上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的捕捉抗体通常是单抗，偶尔有用多抗做为捕捉抗体的情况，但很少见，因为以多抗作为捕捉抗体容易出现交叉反应而降低特异性。检测抗体通常为多抗，在商业化的科研试剂盒中经常用到生物素标记的山羊多抗，再让生物素标记的多抗与HRP标记的亲和素或者链霉亲和素结合，然后再加HRP也就是辣根过氧化物酶的底物，通常是TMB反应显色，这种方法是在传统的HRP酶标记抗体的双抗体夹心法ELISA中引入了生物素-亲和素放大系统。

　　不过也有用单抗做检测抗体的情况，尤其是在科研中。双抗体夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相关的，以及在科研中检测细胞因子等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应，称为双抗体夹心一步法，因为操作时间短，在商业化生产中有很大优势。但双抗体夹心一步法要特别注意ELISA中的钩状效应(hook ffect)，因为此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而无法形成“夹心复合物”，此时测出的结果将低于实际含量甚至是阴性结果。因此，如果使用双抗体夹心一步法测定样本中抗原含量时要注意测量的线性范围，另外使用高亲和力的单抗也可削弱钩状效应。

　　双抗原夹心法中抗原被包被于固相，检测样本中的抗体结合于抗原后，使用酶标的抗原进行结合及后续反应，可以用来测定样本中的抗体。双抗原夹心法的关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构进行设计，在医学检验上测定抗HBsAg抗体采用的就是此法，检测时被测样本不需要稀释即可直接进行测定，故此灵敏度相对而言高于我们随后要说的间接法。

　　竞争法也是一种很常用的方法，一起看看：

　　竞争法是用样本中的游离抗体/抗原与固相的酶标抗体/抗原竞争性结合的分析方法。当游离抗体(或抗原)浓度越高，则能与固定抗原(或抗体)结合的酶标抗体(或抗原)就越少，后续显色就越浅，即与对照相比，显色越浅，表示检测样本中抗体(或抗原)含量越高。该法特别适合小分子物质的检测也可用于检测比较不纯的样本，且重复性好，但是检测的灵敏度和专一性较差。竞争法测抗原常用于检测小分子抗原及半抗原，这类抗原通常缺乏两个以上的识别位点，不适用于双抗夹心法进行测定。该方法在商业化ELISA试剂盒中被广泛运用。

　　最-后再说说间接法，间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。间接法使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。

　　ELISA试剂盒中常用的方法类型!先和大家介绍到这，如果想要了解更多ELISA试剂盒的信息，可以关注天津本生生物，专业给生物医药客户提供生物实验室检测耗材及试剂，欢迎广大客户来询。