硅烷偶联剂与高岭土作用机理？

胱甘肽S-转移酶（GST）是由多基因编码、具有多种功能的超家族酶，GST广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内的一种解-毒系统中，其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他化合物的亲电基团，生成谷胱甘肽衍生物，具有降低化学反应活性的效应。在各种生物体内，GSTs是由多个基因编码的、具有多种功能的一组同工酶，分子量为23∽29kDa，由200∽240个氨基酸组成。有膜结合和胞液两种形式，以胞液GSTs为主。根据蛋白酶的一级序列、免疫原性、酶动力学和三、四级结构的性质，GST又可以分为多个亚类。

GST标签作用机理

1）应用于原核表达，作为一种高度可溶的蛋白，能增加外源蛋白的可溶性，在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用；

2）GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性；

3）GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂（如：盐酸胍或尿素等）；

4）GST融合蛋白已经成为分子生物学领域的基本工具，其广泛用于研究蛋白质-DNA及蛋白质-蛋白质间的相互作用，也可作为抗原用于免疫学或疫苗的研究。

5）GST标签的切除：①凝血酶：一种应用很广泛的蛋白酶，主要特点是经凝血酶切割后的重组蛋白在切割位点的C端会保留两个氨基酸残基。凝血酶可以识别两种类型的氨基酸序列，分别为X4-X3-P-P[K]-X1΄-X2΄和X2-R[K]-X1΄，凝血酶对前一种序列的识别效果更为理想。②Xa因子：Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶，可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列，并将融合标签从其C末端切除。

GST标签纯化蛋白的优劣势：

优势：

1. 适用范围广，可在不同宿主中表达；

2. 增强外源蛋白可溶性；

3. 可用不同的蛋白酶进行去除；

4.   有助于保持蛋白的抗原性与生物活性，提高外源蛋白的稳定性；

5.   特异性好，纯化方便且温和。

劣势：

1.   分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验；

2.   仅能纯化可溶性蛋白，若蛋白不可溶，则很难用变性的方法纯化。

GST标签纯化蛋白常见问题解析：

问题一：GST 融合蛋白的产量低或无法检测到

1、原因：融合蛋白形成包涵体

解决方案：

①采用低温（16∽25℃）培养细胞，或者诱导过程中降低诱导剂的终浓度至1mM，或者缩短诱导时间。

②纯化前需要完全融解和复性。将裂解液与GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶在摇床上轻摇2个小时或者更长时间（过夜），充分结合后上柱纯化。

2、原因：融合蛋白可能失活

解决方案：采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件，比如采用溶菌酶。

3、原因：融合蛋白被蛋白酶降解

解决方案：在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑-制剂，如PMSF。

4、原因：融合蛋白不能有效地从树脂上洗脱下来

解决方案：

①延长洗脱时间，或者增加洗脱液中还原性谷胱甘肽的浓度至15mM或者更高调节洗脱液的pH值至8.0∽9.0。

②在洗脱液中加入Triton X-100（终浓度0.1%）、辛基-葡萄糖苷（终浓度2%）或者NaCl（终浓度0.1∽0.2 M）。

问题二：洗脱液中有较多杂带

1、原因：融合蛋白被蛋白酶降解

解决方案：在裂解步骤或洗涤步骤加入适量的蛋白酶抑-制剂如PMSF。

2、原因：一些宿主蛋白，比如伴侣蛋白，可能会和融合蛋白互相作用

解决方案：

在洗涤液中加入DTT（终浓度5 mM）。在纯化前将重组蛋白溶液和伴侣蛋白溶液(2 mM ATP, 10mM MgSO4, 50 mM   Tris-HCl)，37℃振荡10 min

3、原因：过度的超声处理会导致一些蛋白与融合蛋白相结合

解决方案：采用温和的超声破碎条件或者其他的裂解条件。

4、原因：有些蛋白会与融合蛋白或树脂发生非特异性结合

解决方案：优化洗涤条件：加入一些洗涤剂如1%   Triton X-100、1%Tween-20、0.03%   SDS 或者0.1% NP-40 可以降低非特异性吸附。优化洗涤液中的盐浓度也可以降低非特异性吸附。

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