Western Blot归一化：看家蛋白or总蛋白

做Western Blot的小伙伴，是不是还在为归一化方法而纠结呢？今天小编就和大家汇总一下看家蛋白和总蛋白归一化的方法。

看家蛋白归一化

使用看家蛋白的缺点是在样品间和不同条件下表达水平可能不一致。如使用看家蛋白进行标准化，必须先花费时间和精力来验证内参的选择。

使用看家蛋白的第二个重大挑战是它们的表达丰度很高，如果样品中的看家蛋白表达非常高，这会限制在凝胶上加载的样品量，如果感兴趣的蛋白不是同样的表达丰度，那这两种蛋白质就不在同一线性检测范围内。

如果您正在进行多重蛋白印迹，例如比较同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式，则需要考虑的第三个挑战是从不同物种中产生一抗和二抗的复杂性。

检测的看家蛋白可能干扰感兴趣蛋白的检测。理想情况下，看家蛋白应该与感兴趣蛋白的大小不同，因此这两种蛋白可在印迹上空间分辨。当实验在同一印迹上检查多种目的蛋白时，这就变得越来越困难。

总蛋白归一化

使用总蛋白归一化，是直接在膜上检测总蛋白，并且该值在归一化时用作分母。总蛋白染色提供更宽的动态范围，并且表现出比看家蛋白更低的可变性和更准确的定量数据。

与使用看家蛋白相比，图像采集后的分析工作流程基本不变; 整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化，而不是单一的条带。

例如：JBC、Narute和Proteomics等期刊会推荐使用总蛋白归一化方法。

使用总蛋白染色剂对膜进行染色提供了质控优势，可以验证转印是否完全。

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9月24日北京时间11:00-12:00，Azure Biosystems应用领域专家Stanley Domijan将在Webex Meeting平台在线分享“Western Blot总蛋白归一化原理及如何进行分析”。

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期刊对Western Blot数据要求：

1. 内参和目的蛋白在同一张印迹膜上；

2. zuihao选择膜染色进行总蛋白归一化；

3. 如果使用看家蛋白，需要提供看家蛋白表达稳定并且不受实验条件影响的证据；

4. 成像方法的线性范围需要提供。

看家蛋白一般常用于内参质控，整张膜上的weiyi质控标准，但是看家蛋白一般表达量比较高，可能与目的蛋白不在一个线性范围内，影响定量；并且看家蛋白证明在多种实验条件下是会发生变化，例如：细胞融合，疾病和药物ZL等等，影响定量jingzhun性。

总蛋白质控直接在膜上检测总蛋白，变异性小，误差小，动态范围更宽，使用整个泳道或泳道中大部分信号用于归一化，而不是单一的条带，例如JBC、Nature和Proteomics等期刊推荐使用总蛋白进行归一化。

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做Western Blot的小伙伴，是不是还在为选择何种归一化方法而纠结，看家蛋白还是总蛋白？期刊都推荐总蛋白了，那看家蛋白数据还能用吗？看家蛋白有哪些优点和挑战，需要注意什么？如何选择看家蛋白呢？如选择总蛋白归一化，用什么总蛋白试剂进行归一化，如何进行归一化，优点和挑战是什么？

本周邀请Azure Biosystems产品应用专家刘楚珠给正在迷茫中的小伙伴解惑。

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