DNA测序仪

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  qqd662 2015-12-01 00:00:00

  　　DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用Z多的一种型号。 　　abi prism 310型基因分析仪(即dna测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法)，因此通过单引物pcr测序反应，DNA测序仪生成的pcr产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链dna混合物，使得四种荧光染料的测序 pcr产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在ccd摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为dna序列，从而达到dna测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 　　它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定dna片段的碱基顺序或大小和定量的精密仪器。pe公司还提供凝胶高分子聚合物，包括dna测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用Z新的ccd摄影机检测器，使dna测序缩短至2.5h，pcr片段大小分析和定量分析为 10～40min。 　　由于该仪器具有dna测序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行dna测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，临床上可除进行常规dna测序外，还可进行单核苷酸多态性(snp)分析、基因突变检测、hla配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

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  怀疑的兔子丶 2008-05-21 00:00:00

  这是我在网上找来的，自己感觉说的挺全的，你看看。 不过我要说一句，目前DNA测序所依靠的还是Sanger的原理，只是结合了荧光染料，提高了灵敏度。 DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用Z多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。 【原理】 ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司ZL的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序 PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用Z新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为 10～40min。 由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。 【试剂与器材】 1．BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PEZL四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4．DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。 5．引物 需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。 6．灭菌去离子水或三蒸水。 7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离，PE公司产品。 8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。 10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。 11．POP 6测序胶 ABI产品。 12．模板YZ试剂(TSR) ABI产品。 13．10×电泳缓冲液 ABI产品。 14．ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。 15．2400型或9600型PCR仪。 16．台式冷冻高速离心机。 17．台式高速离心机或袖珍离心机。 【操作步骤】 1．PCR测序反应 (1) 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂： 所加试剂 测定模板管 标准对照管 BigDye Mix 1μl 1μl 待测的质粒DNA 1μl － pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1μl 待测DNA的正向引物 1μl － M13(-21)引物 － 1μl 灭菌去离子水 2μl 2μl 总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。 (2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10s，50℃ 5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。 2．醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物 (1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。 (2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。 (3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。 3．电泳前测序PCR产物的处理。 (1) 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。 (2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。 (3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。 4．上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。 5．仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。 6．测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。 【计算】 测序反应精确度计算公式：－差异碱基数(不包括N数)/650× 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。 【注意事项与评价】 1．ABI PRISM 310基因分析仪是精密仪器，需专人操作、管理和维护。 2．本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，Z好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～4.5μl，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。 3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30～90ng，单链DNA需50～100ng，双链DNA需200～500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为 1.6～2.0，Z好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。 4．本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为 (98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。

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  hsuekgo 2016-03-17 00:00:00

  DNA测序仪： DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今 DNA序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用Z多的一种型号。 原理： abi prism 310型基因分析仪(即dna测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司ZL的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法)，因此通过单引物pcr测序反应，生成的pcr产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序 pcr产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的ccd(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在ccd摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。 它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的精密仪器。pe公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(pop 6)和genescan胶(pop 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用Z新的ccd摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，pcr片段大小分析和定量分析为 10～40min。 由于该仪器具有DNA测序，pcr片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(sscp)、微卫星序列分析、长片段pcr、rt-pcr(定量pcr)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(snp)分析、基因突变检测、hla配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

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