帮忙解释一下qPCR和FISH的原理。

前言

聚合酶链式反应（PCR）是用于扩增特定DNA片段的分子生物学实验技术。实时荧光定量PCR（以下简称qPCR）作为第二代PCR技术，自1996年推出以来，已经广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、动植物育种等许多研究领域，为了获得最理想的检测结果，qPCR从样本采集、核酸提取、cDNA合成到上机检测的流程有许多可以优化的参数。

qPCR实验的工作流程首先需要确定研究的目的，根据实验设计规划好实验分组、重复次数等细节。接下来分为样本准备和引物探针验证两个重要的步骤。样本准备主要是核酸提取逆转录等步骤，引物探针需要去测试特异性和效率。接下来需要使用qPCR仪来对样品中的目的核酸进行扩增qPCR结束后根据实验目的对目的核酸进行相对或者绝对定量。接下来讲的qPCR体系优化会围绕着这个流程展开。

1.样本的采集与处理

首先，提前做好功课，了解样本的不同分型，或者了解详细的细胞分群。如果条件允许尽可能覆盖所有的组织类型或者细胞类型。其次，尽可能增加样本数量，也就是生物学重复，从而更客观地反映生物变异程度。另外，qPCR实验也需要有技术重复来降低误差。

采样是需要严格规划的过程，比如材料的时效性、珍贵程度等，都要纳入考量范围。样品要尽量新鲜，取样尽可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不马上提取核酸，需要-80°C保存，并尽快处理。

2.核酸的提取和检测

模板的质量直接影响到检测性能。核酸提取需要有效地将RNA或DNA从其他混合物中分离。RNA样本中的污染物——基因组DNA、DNA结合蛋白、酚类化合物或在提取RNA过程中引入的外源杂质(如手套中的粉末)——都已被证明会抑制下游实验，如逆转录和PCR扩增。核酸提取需要使用无菌无酶的试剂耗材，避免RNase或DNase污染，并对内源RNAse或DNAse进行有效抑制；多糖多酚样品要考虑多糖多酚杂质的有效去除。低温保存防止RNA或DNA降解。

降解或不纯的RNA会限制逆转录反应的效率，降低产量。部分降解的RNA可能不能给出准确的基因表达结果。对于基因的定量，必须使用高质量的RNA，这意味着需要非常仔细地检查RNA的浓度和质量。可采用高分辨率琼脂糖凝胶检测核酸质量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）检测核酸纯度和浓度。

3.cDNA合成

RNA 质量对 cDNA 合成结果会产生重要影响。并且RNA 很脆弱，容易降解。为了保证 RNA 的完整性，我们需要非常注意，比如在冰上操作，用 RNase-free 的枪头和离心管，减少操作时间等。在反应体系中加入 RNase 抑制剂也能有效防止 RNA 降解。

如何评价样品中的杂质对逆转录的影响呢？可以梯度稀释后绘制标准曲线，如果低浓度的样品点数值偏大比较明显，基本可以判定杂质影响显著。

不同厂家的反转录试剂会有差异，对RNA中的杂质耐受程度也不同。逆转录酶在整个反转录体系中具有关键性影响。除了活性以外，逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少 RNA 的二级结构，增加逆转录的效率。

除了掌握 RNA 的完整性之外，反转录之前还需要对 RNA 浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求，建议 total RNA 上样量小于 5 μg。超过这个范围，会使反转录产物产生偏好性 (表达丰度高的基因优先被反转录) 而造成定量结果不准确。

逆转录出来的cDNA可以直接放在4°C保存，若长期不用，可分装，然后-20°C保存。

4.qPCR方法的建立

① 定量方法

绝对定量：检测起始模板数的精确拷贝数，需要标准品构建标准曲线。

标准品可以是纯化的基因组DNA、质粒DNA或者体外转录RNA(cDNA)，其作用是生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系。

标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%，与样品的性质尽可能接近，与样品相同的扩增条件（PCR体系、耗材、同一次扩增），大于或等于5个梯度稀释的标准品。

相对定量：在一个样本中，目的基因相对于内参基因的量的变化。

内参基因选择建议筛选不少于三个内参基因来归一化RT-qPCR数据。目的是消除外部样品偏差，例如总RNA含量，RNA稳定性，酶效率或样品装载量的变化。

对候选的内参基因进行qPCR 实验，得出Ct平均值以及 Ct值的标准偏差，选择SD最小的基因作为实验内参。可通过geNorm 、 BestKeeper  、 NormFinder、RefGenes 等工具来评估您的内参基因。

② 荧光标记方法

染料法：利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量。

TaqMan荧光探针：是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

引物探针设计可以参考Gene π网站.

③  引物扩增效率验证

标准曲线是评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法，该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。最常用的是10倍梯度稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值，最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时，要求扩增效率范围在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

④  反应体系优化

▶  根据仪器类型，选择合适的耗材和qPCR试剂。

▶ 每对引物先进行预实验，确定特异性以及最适浓度。

▶  配置不同的PCR反应体系，选择每个组分合适的浓度。

▶  设置温度梯度测试引物最合适的退火温度。

▶  实验设置NTC、NRT、 NEG和POS等对照组，来监控实验体系或污染。

实时荧光定量PCR常见问题分析

1.可疑的扩增曲线

真正的扩增曲线，有特征的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）。

如果不是同时具有特征性的三个增长阶段，没有典型的指数增长期，那就不存在扩增。

平台期很低也是常见的异常扩增曲线。可能是模板的浓度太低。通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系中会形成大量的引物二聚体。大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。这种情况可通过调整引物和模板的比例。

2.异常的荧光信号

NTC出现荧光信号---引物二聚体形成或气溶胶污染，查看熔解曲线是否为单一峰。

3.扩增效率过高或过低

过低的扩增效率（<90％）可能存在的原因：

▶  移液器校准不良或移液技术差。

▶ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

▶  引物设计不好或扩增子具有二级结构。

▶  标准曲线动态范围太小。

▶  Taq酶无活性或活性降低。

▶  样品抑制。

过高的扩增效率（> 110％）可能存在的原因：

▶  移液器校准不良或移液技术差。

▶ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

▶  引物二聚体或非特异性扩增。

▶  标准曲线动态范围太小。

▶  基因组DNA污染。

4.重复性差

为精确定量，对每个样品都要做重复实验，复孔之间的Ct值不应超过0.5，标准偏差不大于0.2，这样，实验结果就有很好的精确度。

造成重复性差的原因：

▶  加样误差（操作或者加样器导致）。

▶ 没有将试剂和样品充分混匀。

▶  低拷贝的目的片段→泊松分布。

▶  基线阈值设定不合理。

Cielo™实时荧光定量PCR系统

Harness of the power of qPCR

☑   数据可靠性：连续1000次实验后，结果高度一致。

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☑   流程智能化：中英文用户界面，触控操作，可多机联用。

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大家好！首先跟大家做一个自我介绍：

我是扩增曲线，来自荧光定量PCR，是用于描述qPCR动态进程的曲线，我有两种形态，一种是线性图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值；另一种是对数图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值的对数。大家根据我来确定Cq值，最终确定初始模板的含量。新冠疫情以来，我可是发挥了重要的作用，诊断技术的金标准，骄傲的很呢。

在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下，PCR扩增产物理论上是呈2的倍数增长的，所以我应该是长这个样子的：

▲ 图1. 理论的扩增曲线线性图谱

但是呢，理想很美好，现实却很骨感，随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭等诸多因素影响了PCR扩增效率，实际的我是长这样的：

▲ 图2. 实际的扩增曲线线性图谱

不过S型的曲线，曼妙的身材，我还是很满意的。

大家也根据我将PCR进程分为4个时期，分别为基线期，指数增长期，线性增长期和平台期。我的特征还是很明显的：基线期平整；指数期起峰，陡度较大；线性期慢慢趋于平整；平台期基本平整。

▲ 图3. 扩增曲线的各个时期

如果大家在每次实验中都能遇到如此美丽的我，那就是“你好我好大家好”的欢快场景了。但是在实验过程中，大家可能会看到各种奇形怪状的我，分析不出原因，导致实验止步不前，因此茶饭不思，郁郁寡欢。

其实主要还是大家对我不太了解。我，作为大家的科研小助手，单纯善良，心思简单，没有那么多套路的。之所以出现奇奇怪怪的我，都是有原因的。接下来可都是满满的干货吆！笔记要做起来了吆！

一． 没有Cq值出现

1. 反应循环数不够：一般设定在35个循环以上，也可根据实验情况增加循环数。

2. 引物/探针设计不当或发生降解：优化引物/探针的设计；或通过PAGE电泳检测其完整性。

3. 模板浓度低或降解导致：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；同时样品制备时尽量避免引入杂质和反复冻融。

二．Cq值偏大

1. 模板浓度低：建议提高样本的上样量。

2. 扩增效率低：反应条件不适宜或引物探针设计不当，建议通过绘制标准曲线确认扩增效率，同时对反应条件和引物探针设计进行优化。

3. PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。如果扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物。

4. 反应体系中可能有PCR反应抑制物：建议将模板梯度稀释后加入反应体系，或者重新制备纯度更高的模板。

三．扩增曲线末尾起跳，但没有完整扩增

1. 可能存在污染：建议对样本进行复检。

2. 如果是阴性对照，可能是引物二聚体或污染导致；如果是正常样本，说明浓度过低或者加样量不足。

四．复孔重复性差

1. 加样误差导致：定期校准移液器；同时可先配制除模板以外的其他试剂的预混液，然后进行分装再加入模板，其次加大模板上样体积，以上均可降低移液误差的影响。

2. 模板浓度越低，重复性越差。建议提高模板量，使Ct值在15-30之间。

现在大家对我的了解是不是又多了一些呢？是不是对qPCR实验又充满了信心呢？那就赶紧行动起来吧！Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，没有他就没有我那么多标致的图片，快快申请试用，感受它的魅力呀！

▲ 图4. Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统

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荧光原位杂交（以下简称FISH）是在放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子生物学和细胞遗传学结合的新技术，是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。

FISH技术系用荧光基团标记特异性探针，再将标记了荧光信号的探针与待测样本进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数。Z终通过荧光信号的颜色和数目的异常与否，达到对染色体疾病诊断、恶性肿瘤预测及预后判断的目的。

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