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知道激光共聚焦显微镜的分辨率吗?到底比普通显微镜高多少?

645505276 2014-12-15 13:42:49 928  浏览
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  • shansgshir775 2014-12-16 00:00:00
    真实色共焦显微镜与激光扫描共焦显微镜,二者在成像原理上基本是一样的,Z大不同之处是照明光源不同。1、激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜的照明光源是激光,即单色光。其实际成像过程是根据被观察物体对该单色激光的反射光的强弱来成像的。由于是单色光照明,不能分辨颜色,对于在同一试样的同一视场内,颜色不同,但对该单色激光反射光强度相同的不同组织或成分不能分辨。容易产生同相异色,同色异相的现象,不利于对微观组织和成分的正确分辨。2、真实色共焦显微镜真实色共焦显微镜的光源是氙光源,即白光。其实际成像过程是在白光照明的条件下,对物体形貌(包括颜色)进行综合的成像。由于是多色光照明和成像,真实色共焦显微镜能够更真实的反应物体的颜色和形貌,避免了激光扫描共焦显微镜产生的同相异色,同色异相的现象发生,观察者可以通过颜色,分辨和判断试样的成分和组织。在这方面,其分辨率远强于激光扫描共焦显微镜综合分析:在有颜色差异的试样的观察条件下,真实色共焦显微镜避免了激光扫描共焦显微镜产生的同相异色,同色异相的现象发生,观察者可以通过颜色,分辨和判断试样的成分和组织。在这种条件下,真实色共焦显微镜的分辨率高于激光扫描共焦显微镜。在单色试样的观察条件下,分辨率才接近各自的技术指标。然而,在实际观察的试样中,绝大多数不同的组织和成分都是有颜色差异的。对应于没有颜色差异或颜色差异小的试样,可以通过人为的染色(例如腐蚀处理),提高图像的分辨能力。在这一方面,激光扫描共焦显微镜是无能为力的。另外,分辨率是在特定条件下所能达到的一项技术指标,当在实际使用中,不满足该技术条件时(实际是常常不能满足),其分辨率是达不到所给出的数值。下图是镍铬合金在普通单色激光共聚焦显微镜中的成像,以及使用真实色共聚焦显微镜所成图像的对比,其中红圈内是不同的化合物掺杂,可以清楚看到用单色激光共聚焦显微镜所成的图像,仅凭灰度是无法准确反应其中化合物掺杂的区别的,而真实色共聚焦却可以清楚区分他们的不同。

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人眼的分辨率只有1/ 10mm, 那么比1/ 10mm 小的物体或比1/ 10mm 近的两个微小物体的距离,人眼就无法分辨了。所以出现了从简单的宏观放大镜到微观观测的光学显微镜,继而电子显微镜。显微镜的分辨率定义是指在标本上能清楚分辨的两个小点之间的Z小距离。其计算公式为:

D=0.61λ/NA

式中:D 为分辨率(um);λ 为光源波长(um);NA 为物镜的数值口径(也称镜口率)。

由公式可得到,显微镜的分辨率决定于入射光源的波长以及所匹配物镜的数值孔径。由此可知,提高光学显微镜的方法:

1、降低光源波长。

可见光Z短波长为390nm,若用此波长的紫外光作为照明光源,可使光学显微镜的分辨率降低至0.2um。但是由于大多数普通材料的玻璃会大量吸收340nm以下波长的光,紫外光经过大量衰减无法形成清晰、明亮的图像。因此不得不使用石英(可透过低达200nm的紫外光)、荧石(可透过低达185nm的紫外光)等价格昂贵的材料,并且紫外光显微镜不能用肉眼进行观察,甚至受观测样品的限制,再加上昂贵的造价,所以这种提高显微镜分辨率的方式由于其自身的局限性而不受广泛应用。

2、增加物镜的数值孔径NA.

数值孔径NA=n*sin(u)

式中,n为物镜与标本之间的介质折射率;u为物镜的二分之一孔径角。因此,从光学设计上适当采用较大的孔径角,或者增大折射率成为Z常见的提高光学显微镜分辨率的方法。一般低倍物镜如10X以下其介质采用空气,折射率为1,即干燥系物镜;水浸介质是蒸馏水,其折射率为1.33;油浸物镜介质是香柏油或其它透明油,其折射率一般在1.52 左右,接近透镜和载玻片的折光率,如Olympus 的100X油镜。水浸物镜和油浸物镜不仅放大倍数高而且由于使用高折射率的介质,从而提高物镜的分辨率。


(来源:广州市明美光电技术有限公司 )

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