全封闭Naica数字PCR新型冠状病毒超敏检测方案

全封闭Naica数字PCR新型冠状病毒超敏检测方案

Cycloud与MicroFuture合作

深蓝云生物科技与北京微未来科技，基于国家疾控ZX和WHO推荐区域，针对2019新型冠状病毒的四段保守序列作为检测靶标，开发超敏的数字PCR检测方法和快速的定量PCR检测方法。

【图源：北京微未来科技】

区段分别为：RdRP基因（特异性靶点），E蛋白基因，N蛋白基因，保守基因S区位点。确保对2019新型冠状病毒鉴定的高度特异性和灵敏度。      

与人冠状病毒HcoV-229E、 HcoV-HKU1、 HcoV-OC43、 HcoV-NL63等型无交叉。

深蓝云生物科技以专业服务科学为使命，愿所学，以致用，共战病毒！

北京微未来科技有限公司以“解码病原微生物，致力于传染病防控”为企业使命。与北京深蓝云生物科技共同在病毒的超敏检测的数字PCR方法展开深入合作。 

联系方式：

公司名称：北京深蓝云生物科技有限公司
联系电话：010-57256059
E-mail：info@cycloudbio.com

法国Stilla Technologies公司开发的—款多重PCR专用预混液：naica^®multiplex PCR MIX（见表1），专用于naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统的多重检测。并对naica^®multiplex PCR MIX的多重检测性能进行了详细评估。当面对有限的样本量时，可保证多重数字PCR检测的灵敏度和准确性；在复杂背景基因存在的情况下，依然能精确检出低丰度的目的基因。

★ naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的同步准确定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA样品，使用10X naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统上进行6个靶标的线性范围分析，结果显示6个靶标的R²均＞0.99，说明在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统上，能够可靠地实现6靶标同步准确定量（图1)。与2X和5X浓度的数字PCR预混液(dPCR Mixes)相比，10X浓度的数字PCR预混液体积加入量降低了50％至80％，最大限度地提高样品加入量。尤其是在检测低浓度样品或稀有靶标时，样品加入量的增加可提高检测灵敏度。

▲ 图1：使用naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的线性分析，分别在蓝色、青色、绿色、黄色、红色和红外线6个通道进行检测。每个稀释点的DNA浓度分别为：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每个稀释度进行3次重复。结果显示6个靶标的R2均大于0.99，说明所有靶标的结果都高度真实可靠。

★ 在复杂的背景基因下，对低丰度目的基因进行精确定量

数字PCR的—个重要技术优势是能够在存在多个靶标扩增的情况下检测到低浓度靶标。为了评估naica^®multiplex PCR MIX的稳定性。使用同一个目标DNA模板的不同浓度系列稀释液（0.2~ 13000 cp/uL)进行检测，同时其中掺入5种外部靶标模板（每个靶标的浓度为3000 cp/ul)。在不同测试条件下，结果均呈现良好的线性关系（图2A和2C)。这些结果与同一DNA 靶点在不同浓度下单独检测以及在不添加外部靶标的情况下获得的结果具有可比性（图2B和2D）。

▲ 图2：使用naica^®multiplex PCR MIX的扩增结果真实可靠。将pUC18质粒（图A和B)和pUC57质粒（图C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀释液在5个外部扩增靶标背景下（每个靶标为3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶标(B,D)的情况下进行定量检测，3次重复。线性拟合系数 R2>0.99，表明在不考虑多重背景的情况下，对所有靶标的测定结果都是真实可靠的。5个外部靶标的相对标准偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，显示出极好的重复性。

★ naica^®multiplex PCR MIX应用亮点

☑  实现数字PCR方法多重检测的高度稳定性和高检测灵敏度；

☑  可在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统的动态范围内同时定量检测6个独立的DNA靶标，均具有良好线性关系；

☑  5X和10X的数字PCR预混液，提高了naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统高阶多重检测能力；

☑  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的体积用量，从而增加DNA的加入量。在检测低浓度样品或稀有靶标时，样本加入量的增加可提高检测灵敏度。

表1 naica^®multiplex PCR MIX货号及规格

naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的拷贝数浓度。