反转录试剂盒怎么选 invitrogen

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  z20112012321 2017-01-26 00:00:00

  是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作： 一、cDNA第二链的合成: 1. diyi链反应完成后，取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega): 20ul 10×DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP(自己配制) xul dd H2O 1ul RNase H(2U/ul) 10ul DNA Polymerase I(10U/ul) 总体系为200ul; 2. 混匀后，16℃反应2.5小时; 3. 70℃灭活10分钟; 4. 反应完成后，得到200ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上; 5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。 注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。 二、双链cDNA末端补平: 1. 在第二链反应体系中，顺序加入下列试剂(promega): 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml) 2. 稍微离心混匀反应物， 37℃反应至少30分钟，然后75℃灭活10分钟; 3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇，剧烈振荡后，常温下13000g离心5分钟; 4. 离心后，吸取上清于另一1.5ml eppendof管中，加入等体积氯仿，上下颠倒几次混匀后，常温下13000g离心5分钟; 5. 吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA; 6. 第二日，将昨日沉淀物在4℃，13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA; 7.离心完毕，弃上清，加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，常温下13000g离心5分钟; 8.离心完毕，弃上清，干燥沉淀至无乙醇气味. 注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。 PCR纯化试剂盒操作流程： 1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。 2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。 3．加入spin column中，13000rpm离心1min。 4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。 5．13000rpm，再离心1min。 6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。 7．13000rpm离心2min。 8．加入30ul buffer EB，静置10min。 9．13000rpm离心2min。 10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

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