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湿盒孵育法中如何尽量减少抗体使用

nancy子欲 2017-07-31 05:43:28 541  浏览
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  • 姚坤华 2017-08-01 00:00:00
    免疫荧光基本实验步骤 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。 (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。 (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min。 (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min。 (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞,也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可,尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验,以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察,建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (二)固定和通透 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定。固定的目的有三: ①防止细胞从玻片上脱落; ②除去防碍抗原-抗体结合的类脂; ③使标本易于保存。 标本的固定原则是: ①不能损伤细胞内的抗原; ②不能凝集蛋白质; ③应保持细胞和亚细胞结构; ④固定后应保持通透性,以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。 常用的固定剂有多种,应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类:有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水,同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连,从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构,但因为交联阻碍抗体结合,可能会降低一些细胞组分的抗原性,因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性,因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。 Z常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇,少数情况也使用乙醇,丙酮及戊二醛等进行固定。通常,细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果,而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定,并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。 通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要,因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是,如果待检测的是跨膜蛋白,且其抗原表位处于胞质内区域,则同样需要对细胞进行通透。相反,如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段,则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用,因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用,但有些场合并不适合用甲醇,因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂,如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂,可部分溶解细胞核膜,因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是,如果在高浓度下使用或者作用时间过长,它们将破坏蛋白,从而影响实验结果。Triton X-100是Z常用的通透剂,但是它将破坏细胞膜,因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温和得多,它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过,但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原,也适于可溶性的核抗原。 一般的操作程序是先固定后通透,但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定,这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白,从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗,Z后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光。 (三)封闭 封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合,Z常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5,其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清(3-10%)等。 (四)抗体孵育 直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体,因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外,为保证结合质量和防止干燥,抗体孵育应尽量在湿盒中进行。 (五)封片及荧光观察  标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察,特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下,为了保存结果,以便进一步观察、照像、统计分析等,需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片,为了增强封片的效果,往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。 (六)标本保存 由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的,因此随着保存时间的延长,在各种条件影响下,标记蛋白可能变性解离,失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难,所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现,荧光标记的标本可以在低温(4℃或-20℃)下保存相当长的时间。在某些情形下,考虑到实验的成本及实验条件,也可以采取权宜的办法,比如固定标本片后低温保存,在需要时再进行荧光标记,即随用随染。

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压汞法孔隙度测试分析技术是基于在精确控制的压力下将汞压入孔结构中的方法实现的。除高速、精确及分析范围广等优点外,压汞仪还可得到样品众多特性,例如:孔径分布、总孔体积、总孔比表面积、中值孔径及样品密度(堆积密度和骨架密度)。

孔隙度通常包括材料孔径、孔体积、孔径分布、密度和其他孔隙度相关特性的测量。孔隙度对于了解物质组成、结构和应用是非常重要的。材料的孔隙度影响其物理属性从而影响其在周围环境下的行为,影响材料的吸附性和渗透性、强度、密度和其他性质。


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但是人们在操作流程中,留意某些小关键点,也可以保证让机器设备降低耗能,环保节能节电。

  • 1、恰当放置机器设备

试验线要放到荫凉自然通风的自然环境,谨记防止太阳照射,机器设备的上下及背部都必须留出适度的室内空间,便于热管散热,于环境试验箱周边的工作温度高将提升环境试验箱的用电量。

  • 2、定期维护密闭性

环境试验箱门的密封环立即危害到机器设备的密封性特性,假如密封胶条出現脆化、形变等状况请立即拆换,不然就会危害关掉的紧闭水平,导致致冷或加温泄露,进而提升用电量。

  • 3、在多余的标准下严禁开启尾门

每开启多次尾门,就会有冷气机或是热流露出或泄露,那样就务必得再运行致冷或加温系统软件。假如必须必须开启门,尽量姿势要快,开关门视角尽可能小一点儿。

  • 4、按时清除尘土

制冷压缩机和冷却器的表层,每过四个月应清除多次,尘土越大,热管散热实际效果越差,用电量进而也就增大了。

除开恰当实际操作实验室恒温恒湿设备外,实际操作工作人员还需掌握机器设备的维护保养、清理及简单常见故障的解决小常识。二者相辅相成不但能平稳机器设备,在机器设备突发性常见故障时,人们也不会不知所措了。

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如何减少ELISA试剂盒实验中背景因素?

  如何减少ELISA试剂盒实验中背景因素?

  ELISA试剂盒实验的原理在我们平时看来觉得很简单,无非就是固定抗原,添加一抗、二抗和底物,间中夹杂着洗涤和闭。然而,即使是平常的洗涤和封闭,如果做得不太好,也有可能影响整个实验。在做完实验时,我们是否能获得有用的信息,这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会直接关系到结果的判断。那么怎样才能降低ELISA试剂盒实验中的背景因素呢,我们一起来了解。

  洗涤很重要

  洗涤步骤看似很无聊,其实很重要,因为如果未结合的材料(如非特异结合的抗体或检测试剂)残留在微孔板中,那么它会增加背景噪音。如有必要,可增加洗涤液中的盐浓度,这会阻止非特异结合反应。如果背景过高,而您怀疑洗涤不够时,可以尝试增加洗涤次数。

  封闭更关键

  封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高,怀疑封闭不充分,那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液,或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰,那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间,但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液:蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素,包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合,但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。zui常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定,在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用,因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度(正常浓度为0.01-0.1%),它会降低特异结合,产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液,后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同。它们与开放位点结合并封闭,同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。

  抗体浓度须优化

  如果试剂稍有不同,则可能需要优化抗体的量。记住,非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点,切勿使用过多的一抗或二抗。

  检测试剂要适量

  另一点也很显而易见:切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高,或者未正确稀释,则会导致高背景。也不要显色过度,如有必要,优化一下何时应加入终止液。

  相信在注意这些细节后,我们就可以降低ELISA试剂盒实验中背景因素,才可以获得我们想要的结果信息。

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