体外合成DNA方法和原理

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  小啦啦gg 2012-04-05 00:00:00

  现有体外合成DNA的方法主要就是PCR（即聚合酶链式反应）了 基本原理是：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 具体工作流程：　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 还有的话那就是利用DNA合成仪了 原理与过程：DNA的固相合成。 即DNA3'端固定于基质上，然后沿3'向5'方向依此添加核苷酸直至合成所需的DNA片段。不同于应用DNA聚合酶的DNA合成。 合成过程 diyi个碱基的3‘末端固定在树脂上，下一个碱基的5’-OH用二对甲氧三苯甲基DMT保护，碱基上的氨基用苯甲酸保护，然后对3‘-OH用氨基磷酸化合物进行活化。 1。1个碱基的5’-OH和下个碱基的3‘-OH形成亚磷酸三酯， 2。然后用碘氧化成磷酸三酯 3。加入二除去第二个碱基5’-OH上的保护剂DMT 循环进行加入下一个碱基 合成完毕后 1。用苯硫酚除去5’-OH上的保护剂DMT 2。用浓氢氧化铵将片段与固体树脂断开，洗脱 3。用浓氢氧化铵在加热的条件下除去碱基上的保护剂 4。除去氢氧化铵，真空抽干 5。液相色谱或者PAGE，回收片段Z长的。

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