求助：有什么好方法或试剂盒做反向PCR

　　天津本生|PCR八联管试剂盒的清洗方法及注意事项

　　实验方法原理：硅胶膜在高盐条件下结合DNA，可在低盐条件下与DNA分离。用于清洁目的的含DNA溶液中的引物，单核苷酸，酶，矿物油，盐离子等被分离，因为它们与DNA没有相似的性质。

　　实验材料：PCR产物，试剂，试剂盒，PCR清洁套件，仪器，消耗品，96孔DNA制备板96孔深孔板96孔V形板

　　一、PCR八联管厂家谈试剂盒的组成，储存，稳定性

　　1、说明书，消耗品：96孔DNA制备板，96孔1.6ml深孔板，96孔V形板。

　　2、缓冲液PCR-A：DNA结合溶液。在室温下以密封状态储存。如果发生沉淀，应将其溶解在65°C的温浴中，并在使用前冷却至室温。

　　3、缓冲液W2浓缩液：除去盐溶液。使用前，根据瓶子上的体积加入乙醇，充分混合，并在室温下保存。可以使用100%乙醇或95%无水乙醇。

　　4.洗脱液：2.5mM Tris-HCl，pH 8.5，在室温下以密封状态储存。

　　二、PCR八联管操作步骤

　　用户可以选择负压或离心。

　　A.负压法

　　1、正确连接负压装置，将96孔DNA制备板放在负压装置上;在PCR，酶消化，酶标记或测序反应溶液中加入3倍缓冲液PCR-A(如果缓冲液PCR-A小于100μl，加入100μl);充分混合并转移至96孔DNA制备板，打开并调节负压至-25-30英寸汞柱，并缓慢吸出板中的溶液。

　　2、加入0.3 ml缓冲液W2并吸收溶液。用相同的方法用0.3ml缓冲液W2洗涤两次。

　　确认在试剂瓶上的体积的缓冲液W2浓缩物中加入无水乙醇。

　　3、维持负压并提取96孔DNA制备板10分钟。

　　4、在长纤维组织上将96孔DNA制备板粉碎6次，引流管朝下。

　　5、将96孔DNA制备板置于96孔V形板上，加入25-30ul水或洗脱至膜ZX，在室温下静置1分钟。通过以3 000×g离心5分钟洗脱DNA。

　　B.离心

　　1、在PCR，消化，酶标记或测序反应中加入3倍体积的Buffer PCR-A(如果Buffer   PCR-A小于100μl，加100μl);混合并转移到制备板96孔中的96孔DNA中。将DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中，以1000×g离心1分钟，弃去滤液。

　　2、在96孔DNA制备板中，加入0.3ml缓冲液W2，以1000×g离心1分钟，弃去滤液。用0.3ml缓冲液W2以相同方式再次洗涤。确认在试剂瓶上的体积的缓冲液W2浓缩物中加入无水乙醇。

　　3、将96孔DNA制备板置于96孔1.6ml深孔板中，并以3 000×g离心10分钟。

　　4、将96孔DNA制备板置于干净的96孔V形底板中，加入25-30ul水或洗脱至膜ZX，在室温下静置1分钟。通过以3  000×g离心5分钟洗脱DNA。

　　PCR八联管注意事项：

　　1、将洗脱液或水加热至65°C有助于提高洗脱效率。

　　2、DNA分子是酸性的，建议储存在2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5洗脱液中。

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