【新方案】Xevo TQ Absolute高灵敏度分析二甲双胍中的亚硝胺杂质

亚硝胺杂质被视为潜在的人类致癌物或可致癌化合物。为控管药品中存在的亚硝胺，美国FDA和欧洲药品管理局(EMA)规定了药品中亚硝胺可接受的每日摄入限量（纳克/天）, 根据特定药品推荐的每日最 大剂量，使用这些限值可确定药品中亚硝胺的阈值浓度。

二甲双胍是⼀种处 方药，可用于治 疗2型糖尿病患者的⾼血糖, 有几款二甲双胍药品由于NDMA含量超过了96纳克/天的可接受摄入限值而被召回。

药品中存在亚硝胺杂质会对⼈体健康构成极大风险，必须使用高灵敏度和选择性的分析方法进行监测，并要求精度达到亚ng/mL水平。本文主要介绍使用 Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪配合 超高效液相色谱ACQUITY Premier系统开发的方法用于检测和定量分析⼆甲双胍药物中九种亚硝胺杂质(NDMA、NDEA、NEIPA、NMOR、NDIPA、NDPA、NMPA、NMBA、 NDBA)的性能。

图1. Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪配合超高效液相色谱ACQUITY Premier系统。

实验分析

01、样品制备

• 将每种亚硝胺各5.0 - 10 mg/mL的单标储备液溶于甲醇中，制备含九种亚硝胺(100 μg/mL)的混标溶液。用水连续稀释混标溶液，制备LOD、LOQ和线性标准溶液。

• 用水制备浓度为20 mg/mL的⼆甲双胍药物样品溶液，然后用0.2 μm/mL的 PVDF针头式过滤器(P/N: WAT200806)进行过滤以备分析。

02、液相色谱条件

• 液相色谱系统： ACQUITY Premier系统

• 检测条件： MS/MS

• 样品瓶： LCMS最 大回收样品瓶，容积2 mL，P/N: 600000670CV

• 色谱柱： Atlantis Premier BEH C18 AX (2.1 x 100, 1.7 μm)，P/N: 186009368

• 流动相A： 含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵的水溶液

• 流动相B： 含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵的甲醇溶液

03、质谱条件

• 质谱系统：Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪

• 电离模式：APCI+

• 采集：MRM模式，如表1所述。

• 表1. 使用Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪的MRM通道设置，所有亚硝胺的采集均设置为13点/峰和Auto Dwell（自动驻留）。

04、数据管理

• 仪器控制：MassLynx v4.2

• 数据处理：TargetLynx

05、结果与讨论

• 纯溶剂中的定量分析

  该UPLC-MS/MS方法所能达到的亚硝胺LOD和LOQ分别是按照3:1和10:1的信噪比(S/N)标准确定的。纯溶剂中LOQ溶液的代表性色谱图如图1所示。表2总结了方法的性能特征，包括LOD、LOQ和线性。LOQ对于20 mg/mL⼆甲双胍药物来说相当于0.005和0.0005 ppm。根据六次重复进样的数据（表2），峰面积的相对标准偏差(RSD)低于10%，证明该方法在检测亚硝胺的LOQ方面性能优异，此外，本该方法显示了MS响应和浓度之间的线性关系，相关系数≥0.996（表2）。

图2. 用纯溶剂（水）制备的亚硝胺标准溶液（LOQ水平）的代表性色谱图，使用Xevo TQ Absolute在MRM模式下采集，S/N为PtP（峰到峰）。

表2. 使用Xevo TQ Absolute在MRM模式下分析纯溶剂中亚硝胺的方法性能。* 相对于20 mg/mL⼆甲双胍的LOQ(ppm)。

⼆甲双胍药物中的定量分析

在MRM采集模式下分析20 mg/mL的⼆甲双胍药物水溶液，检测其中存在的亚硝胺。该方法可以准确测量⾼浓度⼆甲双胍供试品中的亚硝胺杂质。分析⼆甲双胍药物和加标后⼆甲双胍药物样品中亚硝胺(NDMA、NDEA、NMOR和NEIPA)的代表性色谱图如图3所示。⼆甲双胍加标样品中亚硝胺的MS响应和S/N与纯标准溶液中的值相当，表明高浓度⼆甲双胍峰没有离子 抑 制作用。图3为分析20 mg/mL⼆甲双胍药物(DS)和加标后⼆甲双胍供试品中亚硝胺的代表性色谱图。使用TargetLynx软件，通过对比计算浓度和已知的加标浓度计算出百分比回收率。用⼆甲双胍药物制备的校准标样计算亚硝胺的回收率。⼆甲双胍药物中亚硝胺标准品的标准曲线显示MS响应与浓度呈线性关系，R2≥0.999（图4）。该方法对二甲双胍药物中的所有亚硝胺均表现出优异的准确度（表3）。对于NDMA，0.1 ng/mL和1 ng/mL时的回收率分别为89 - 98%和93 - 98%；对于其他杂质，0.025 ng/mL（或0.00125 ppm，相对于20 mg/mL⼆甲双胍药物）时的回收率为85 - 110%，5个样品的RSD ≤ 6.50%。

图3. 分析20 mg/mL⼆甲双胍药物(DS)和加标后⼆甲双胍供试品中亚硝胺的代表性色谱图。

图4. 用⼆甲双胍药物制备的亚硝胺标准品的标准曲线(NDMA:0.1 - 10 ng/mL，其他杂质：0.025 - 10 ng/mL）。

表3. 方法准确度：以不同浓度加标到20 mg /mL时⼆甲双胍药物中亚硝胺的回收率（样品n = 5）。

结论

本研究利用Xevo TQ Absolute质谱仪和ACQUITY Premier系统开发了⼀种高灵敏度方法，能够对⼆甲双胍药物中的亚硝胺进行超微量检测和定量分析。使用Atlantis Premier BEH C18 AX色谱柱完成出色的色谱分离。该方法显示出优异的定量性能，在纯溶剂和20 mg/mL⼆甲双胍药物中的LOQ分别达到0.01 - 0.1 ng/mL和0.025 - 0.1ng/mL。⼆甲双胍药物中亚硝胺的线性和准确度结果分别为R2 ≥ 0.999、回收率为85 - 110%。

本文所述的UPLC-MS/MS方法可对⼆甲双胍药物中的亚硝胺进行高灵敏度、高专属性和准确的分析，达到准确监测残留亚硝胺的目的，这对于产品质量和安全至关重要。

简介 

总有机碳（TOC，Total Organic Carbon）分析，为 必须进行有机碳分析的工艺提供有价值的数据信息 。准确测量低 TOC 浓度（mg/L）对于保护设备、 控制工艺、确保产品质量来说至关重要。但当氯化 钠（NaCl）、氯碱、药物浸出物和提取物的浓度过 高时，就会给 TOC 分析造成较大困难，其中包括： 

- 阳离子和阴离子的无机物干扰 

- 由于氯化物吞噬氧化剂，氧化受限 

- 高悬浮或溶解固体 

- 污堵燃烧催化剂 

- 盐酸（HCl）造成仪器损坏 

- 5 mg/L 碳浓度以下，灵敏度受限

解决方案

Sievers* InnovOx TOC 分析仪特别适用于分析高盐 样品中的有机碳。其超临界水氧化（SCWO， Super Critical Water Oxidation）技术提供精确、准 确、灵敏的 TOC 定量分析，通过消除无机物干扰使 氧化效率达到Z 高。此技术能够增加反应器中的待 测物量，并更精确地控制气体和样品流量，从而达到 6M NaCl 中 50 μg/L 的碳检测限（LOD，Limit of  Detection）。

仪器优越的稳固性和样品处理能力提供了对腐蚀性盐酸的高度耐受性，特别适用于高溶解性和悬浮固体样品。InnovOx 成为分析高盐样品的理想工具， 其他优点包括：

- 无催化剂或燃烧管污堵或损坏 

- 低耗材成本 

- 无需空气泵 

- 生成在线、实时工艺数据（使用 InnovOx 在线 型分析仪）

技术 

SCWO 技术将有机碳分子氧化成二氧化碳，然后用 非色散红外（NDIR，Non-dispersive Infrared）检 测技术进行定量分析。样品在水的热力学临界点以 上被加热加压。在此条件（375℃和 220 bar）下， 水成为超临界液体，有机物高度可溶，而无机盐却 不可溶。即使溶液中有高浓度无机盐，这些条件也 能够提高氧化效率，使仪器有效测量侵蚀性和复杂 基体中的 TOC。

NDIR 检测器稳定可靠，校准频率为 6 个月。 InnovOx TOC 分析仪能够准确测量含有悬浮和溶解 固体（<800 微米）的样品中的 TOC。

性能数据

InnovOx 的 LOD 规格为 50 μg/L。 LOD 不同于方法 检测限（MDL，Method Detection Limit）。通过 15 次重复测量用超纯水制成的 6M NaCl 空白样品 来确定 MDL。TOC 结果的标准偏差为 σ，则 MDL 等于 3σ。在图 1 中，TOC 数据的标准偏差为 20  μg/L，产生 60 μg/L 的 MDL。这与仪器的 50 μg/L  LOD 规格相似，表明 InnovOx 检测Z 低 250 微克/ 升有机碳的能力不受饱和 NaCl 溶液的影响。

图 1：6M NaCl 方法检测限数据

分别将 250、400、600 μg/L 的蔗糖加标到 6M NaCl 溶液中，然后用 InnovOx 进行分析，由此来确定 TOC 回收率的精确度和准确度。分析参数为：3% （体积百分比）HCl、25%（体积百分比）过硫酸钠氧化剂、0.8分钟吹扫时间。表1中的结果显示， 相对于加标值，回收率的偏差在 5% 以内。甚至低于 500 μg/L 时，相对精确度也好于 15%。图 2 是回收率/标样的比较。在 250 μg/L 至 600 μg/L 范围内 的回收性能进一步表明，InnovOx 不受 6M NaCl 基 体的影响，甚至在低于 1 mg/L TOC 时也不受影响。

表 1：6M NaCl 中低于 1mg/L 的 InnovOx TOC 分析性能

图 2：6M NaCl 中低于 1 mg/L 的 TOC 回收率

结论 

Sievers InnovOx TOC 分析仪适用于恶劣环境和复杂 水体。SCWO 技术和 NDIR 检测技术能够对饱和盐 溶液进行 ppb 范围的 TOC 定量分析。

简介

      总有机碳（TOC，Total Organic Carbon）分析，为必须进行有机碳分析的工艺提供有价值的数据信息。准确测量低TOC浓度（mg/L）对于保护设备、控制工艺、确保产品质量来说至关重要。但当氯化钠（NaCl）、氯碱、药物浸出物和提取物的浓度过高时，就会给TOC分析造成较大困难，其中包括：

• 阳离子和阴离子的无机物干扰

• 由于氯化物吞噬氧化剂，氧化受限高悬浮或溶解固体

• 污堵燃烧催化剂

• 盐酸（HCl）造成仪器损坏

• 5mg/L碳浓度以下，灵敏度受限

解决方案

       苏伊士Sievers® InnovOx TOC分析仪特别适用于分析高盐样品中的有机碳。其超临界水氧化（SCWO，Super Critical Water Oxidation）技术提供精确、准确、灵敏的TOC定量分析，通过消除无机物干扰使氧化效率达到Z高。此技术能够增加反应器中的待测物量，并更精确地控制气体和样品流量，从而达到6M NaCl 中50μg/L的碳检测限（LOD，Limit of Detection）。

       仪器优越的稳固性和样品处理能力提供了对腐蚀性盐酸的高度耐受性，特别适用于高溶解性和悬浮固体样品。InnovOx成为分析高盐样品的理想工具，其他优点包括：

• 无催化剂或燃烧管污堵或损坏

• 低耗材成本

• 无需空气泵

• 生成在线、实时工艺数据（使用InnovOx 在线型分析仪）

技术

       SCWO技术将有机碳分子氧化成二氧化碳，然后用非色散红外（NDIR，Non-dispersive Infrared）检测技术进行定量分析。样品在水的热力学临界点以上被加热加压。在此条件（375℃和220bar）下，水成为超临界液体，有机物高度可溶，而无机盐却不可溶。即使溶液中有高浓度无机盐，这些条件也能够提高氧化效率，使仪器有效测量侵蚀性和复杂基体中的TOC。

       NDIR检测器稳定可靠，校准频率为6个月。InnovOx TOC分析仪能够准确测量含有悬浮和溶解固体（<800微米）的样品中的TOC。

性能数据

       InnovOx的LOD规格为50μg/L。LOD不同于方法检测限（MDL，Method Detection Limit）。通过15次重复测量用超纯水制成的6M NaCl空白样品来确定MDL。TOC结果的标准偏差为σ，则MDL等于3σ。在图1中，TOC数据的标准偏差为20μg/L，产生60μg/L的MDL。这与仪器的50μg/L LOD规格相似，表明InnovOx检测Z低250微克/升有机碳的能力不受饱和NaCl溶液的影响。

       分别将250、400、600μg/L的蔗糖加标到6M NaCl溶液中，然后用InnovOx进行分析，由此来确定TOC回收率的精确度和准确度。分析参数为：3%（体积百分比）HCl、25%（体积百分比）过硫酸钠氧化剂、0.8分钟吹扫时间。表1中的结果显示，相对于加标值，回收率的偏差在5%以内。甚至低于500μg/L时，相对精确度也好于15%。图2是回收率/标样的比较。在250μg/L至600μg/L范围内的回收性能进一步表明，InnovOx不受6M NaCl基体的影响，甚至在低于1mg/L TOC时也不受影响。

表1: 6M NaCl中低于1mg/L的InnovOx TOC 分析性能

图1: 6M NaCl方法检测限数据

图2:6M NaCl 中低于 1mg/L 的 TOC 回收率

结论

       Sievers InnovOx TOC分析仪适用于恶劣环境和复杂水体。SCWO技术和NDIR检测技术能够对饱和盐溶液进行ppb范围的TOC定量分析。

伦敦金属交易所(London Metal Exchange,LME)是世界上Z大的有色金属交易所，成立于 1876 年，于 2012 年被香港证券交易所英镑收购，成为其全资附属公司。伦敦金属交易所的交易品种主要有铜、铝、铅、锌、镍和铝等，发布的成交价格被广泛作为世界金属贸易的基准价格，其价格和库存对世界范围的有色金属生产和销售有着重要的影响。如同 24K 金与 18K 金的差价一样，不同纯度金属的价格差异明显。因此，伦敦金属交易所对交易金属的纯度有着严格的分级和要求，对检测手段也有着严格的规范。

从本文开始，我们将陆续推出伦敦金属交易所有色金属质量控制系列 —— 高纯基体金属的 ICP-OES 分析，以镍、铅、铝等为例，让大家了解电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)技术在分析高纯度金属基体中的杂质元素的应用，以及珀金埃尔默 Avio 系列 ICP-OES 在此领域应用的技术特点和优势。

ICP-OES 的英文为 Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer，基本原理简单说来就是元素的原子或离子受热或电激发后，发生电子层跃迁，随后从激发态回到基态时发射出具有特征波长和强度不同的电磁辐射，从而进行元素的定性和定量。ICP-OES 系统的组成如下图所示。

ICP-OES 技术具有GX稳定，连续快速多元素同时测定，精确度高，检测线性宽等特点，能够进行 70 多种金属元素和部分非金属元素的分析，多数元素的检出限能达到 ppb 级，在地质、冶金、环保、化工、生物、医药、食品、农业等方面用途广泛。

那么，让我们先从用途Z为广泛的合金材料之一金属镍中的杂质检测开始说起吧！

金属镍中的杂质检测

金属镍(Ni)由于其具备高温和低温下的高耐腐蚀性和高强度，成为合金材料生产制备中Z广泛使用的金属材料之一。伦敦金属交易所发布了不同规格的金属镍的杂质要求，表 1 列举了99.80% 纯度金属镍标准规范中的杂质要求。

表1.伦敦金属交易所 99.80% 纯度金属镍（镍标准规范）

众所周知，谱线干扰是使用 ICP-OES 检测高纯基体金属样品中的杂质时常常遇到的难题。我们看看珀金埃尔默如何使用 Avio 500 电感耦合等离子体光谱仪(ICP-OES)，并利用多谱拟合ZL技术(MSF)解析谱线，成功消除主体元素 Ni 对 某些杂质元素如 Bi 和 Sn 的测定干扰，准确检测高纯度金属镍中的杂质元素。

样品

样品以 5% 硝酸(v/v)消解。按照“99.80% 纯度金属镍标准规范”的要求，所有分析在 1% Ni 溶液中进行，并按照其对杂质元素含量的规定进行加标回收实验。

标准工作曲线

用 5% 硝酸(v/v)溶液配制浓度水平为 0.25，0.5 和 1.0 ppm 的混合标准溶液。

仪器

珀金埃尔默 Avio 500 ICP-OES，仪器参数、实验条件设置见表 2，各杂质元素的测定波长见表 3。

表2. Avio 500 ICP-OES 仪器参数和实验条件

表3. 各杂质元素的测定波长

回收率

混合标准溶液加到 1% Ni 溶液中的回收率均在 ±10% 以内，结果如图 1 所示，表明能够准确检测低浓度的杂质元素。

图1. 各杂质元素在 1% 浓度 Ni 溶液中的加标回收率

干扰消除

在检测中，Bi 和 Sn 的测定会明显受到 Ni 基体的光谱干扰。使用珀金埃尔默多谱线拟合(MSF)ZL技术（原理如图 2 所示），建立模型，可以消除 Ni 谱线干扰。

图2. 珀金埃尔默多谱线拟合(MSF)ZL技术

方法检出限

方法检出限定义为连续 7 次测量 1% Ni 溶液中各杂质元素为 0.25 ppm 的测量值的标准偏差的 3 倍，结果如图 3 所示，表明方法的检出限符合金属镍标准规范要求。

图3. 1% Ni 溶液中各杂质元素的检出限（蓝色）和金属镍标准规范要求（红色，按100倍稀释99.80%纯 Ni 计算）

仪器稳定性

通过 6 小时连续分析 1% Ni 溶液中内标物 钪(Sc)的光谱信号强度的变化考察仪器的稳定性，结果见图 4，信号强度的变化在 ±10% 以内，表明仪器有着良好的稳定性 。

图 4. 1% Ni 溶液中内标物钪(Sc)的光谱信号强度变化

本文证明了珀金埃尔默 Avio ICP-OES 可以对高纯 Ni 中的杂质元素进行准确分析，符合伦敦金属交易所对高纯金属 Ni 的要求。通过使用多谱线拟合(MSF)技术解析谱线， 成功消除了主体元素 Ni 对 Bi 和 Sn 的测定干扰。

Avio 200 ICP-OES

Avio 500 ICP-OES

扫描下方二维码，即可下载珀金埃尔默ICP-OES相关应用资料。

下期预告

伦敦金属交易所有色金属质量控制系列（2），高纯金属基体的ICP-OES分析：Avio 500 分析金属铅中的杂质，将介绍伦敦金属交易所对金属铅的标准规范，以及Avio 系列ICP-OES在其分析中，特别是在成本控制方面的表现，敬请期待。

癌症仍然是威胁人类健康Zda的敌人之一，虽然目前针对癌症的ZL方案有了很大的发展，但是癌症治愈难并且ZL费用高的现状仍然不会在短时间内得到改善。因此，除了在ZL阶段应对癌症外，早期的诊断检出仍然是降低肿瘤死亡率的重要手段。

除常规筛查外，内源性肿瘤标志物的检测成为当前发展的新兴技术，其中包括CTC，ctDNA以及肿瘤外泌体等的检测。内源性标志物检测的难点在于体内标志物会快速清除且检测背景高以及体内无法富集都是导致它们应用难以推广的重要原因。

为解决这个难题，美国斯坦福大学医学院的San极v Gambhir博士团队对免疫细胞中的巨噬细胞进行改造，成功在小鼠肿瘤模型中实现肿瘤细胞的早期检测和跟踪标记。

其主要策略是：通过对巨噬细胞进行改造，在肿瘤诱导产生的M2型巨噬细胞的启动子后面标记上生物发光的标记。当在肿瘤环境中，可以更加诱导巨噬细胞向M2型分化，并启动荧光素酶基因的表达。利用该策略可以检测出转移瘤以及皮下瘤的发生。

目前，这项技术可用于检测直径小至4毫米大小的肿瘤，不仅更加优于常规肿瘤体积检测，而且与常见生物标志物检测相比，如体外RLU方案，CEA指标检测方案 ，ctDNA，qtPCR方案等检测，表现出更高的灵敏度。

参考文献

San极v S. Gambhir et al. Engineered immune cells as highly sensitive cancer diagnostics. Nature Biotechnology (2019).