细胞内蛋白质大分子怎么分离纯化

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  姐姐是魔鬼 2017-03-09 00:00:00

  破细胞 过Ni柱 过分子筛 过离子交换

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  厄尔多思2 2017-03-09 00:00:00

  蛋白质分离提纯的一般原则 1. 前处理 把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态，并不丢 失生物活性。常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。 超声波破碎法：当声波达到一定频率时，使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压，这个低气压使液体转化为气体 ，即形成很多小气泡。由于局部压力的转换，压力重新升高，气泡崩溃。崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中，形成剪切力使细胞破碎。 2． 粗分级 分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大， 3． 细分级 样品的进一步纯化。样品经粗分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为Z后的纯化步骤。 结晶是Z后的一步 分离纯化的方法：1．分子大小；2.溶解度；3.电荷；4.吸附性质；5.对配体分子的生物亲和力等。 (一)根据分子大小不同的纯化方法 1. 透析 利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。 2. 密度梯度离心。 蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。 3. 凝胶过滤 利用蛋白质分子大小，因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，其内部是多孔的网状结构。当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并Z先流出柱外，比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外，由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离。大分子先被洗脱下来。小分子后被洗脱 (二)利用溶解度差别的纯化方法 1．等电点沉淀和PH的控制 蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到Z底点，利用等电点分离蛋白质是一种常用的方法。 2. 蛋白质的盐溶和盐析 中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。盐溶作用是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水相互作用加强了，因而溶解度增加 当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降。当离子强度足够高时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。 盐析作用的主要原因是大量中性盐的加入使水的活性降低，原来溶液的大部分甚至全部的自由基水转变成盐离子的水化水

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