微液滴数字PCR(ddPCR)油相7500试剂

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。

DDPCR的原理是在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

在ddPCR中的微液滴产生中，ddPCR-DG7500油相可以直接和PCR扩增试剂（包含待测的DNA样品）注入到液滴合成芯片中，产生所需要尺寸的乳液滴微球。随后，将获得的乳液滴微球进行PCR扩增。

ddPCR-DG7500油相是一种包含PFPE-PEG混合结构的HFE7500油相溶液，可以直接用于ddPCR中的乳液微球产生，无需再进行二次处理。该油相可以帮助用户节省实验时间，获得良好的实验结果，同时把精力用于目标产物上，不用担心因油相质量不稳定而产生的不良目标产物。

ddPCR-DG7500油相试剂是一种液体状态，提供1mL包装和2mL包装的两种规格。

名称：数字PCR油相7500试剂

型号：ddPCR-DG7500

规格：液体状态，4℃环境保存，体积：1mL，EP管包装，即开即用。

FluoSurf (2%, w/w) in HFE 7500 含氟表面活性剂 

Zhu B, Du Z, Dai Y, Kitguchi T, Behrens S, Seelig B. Nanodroplet-based reagent delivery into water-in-fluorinated-oil droplets. ChemRxiv. Cambridge: Cambridge Open Engage; 2023;  

体外区隔化是一种生成油包水微滴的技术，用于建立基因型(DNA信息)-表型(生物分子功能)连锁，这是许多生物学应用所需要的。近年来，由于氟化油具有较好的生物相容性，在微滴制造中得到了越来越广泛的应用。然而，需要在含氟水的油微滴中添加试剂来进行多步反应是困难的。芯片上的微滴操作通常用于此目的，但它可能遇到一些技术问题，即低通量或将试剂递送到不同的微滴中有时间延迟。因此，我们评估了采用基于纳米液滴的方法使用铜离子和中等大小的肽(2 kDa)分子来解决这些问题的可行性。

导读

反刍动物是指具有反刍习性的一类哺乳动物，如牛、羊、长颈鹿、兔子等。反刍动物采食一般比较匆忙，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼混入唾液并再吞咽进入瘤胃，这种行为称为反刍行为。反刍动物的食物种类比其他种类的动物更丰富，结构组成也更复杂，但草料中的粗纤维含量较高导致其难以消化，反刍动物依赖于胃部微生物群的代谢能力来消化各种物质，但其转化效率低也是养殖业广泛关注的问题。

虽然已有研究证明瘤胃中不同微生物的活性可以调节宿主利用植物生物能量的能力，但定植于宿主瘤胃中的微生物却很少受到关注。奥地利维也纳兽医大学的Cameron等人在Research Square在线发表了题为《Differential partitioning of key carbon substrates at the rumen wall by recently diverged Campylobacteraceae populations》的研究论文。文章采用多重数字PCR（dPCR）量化同一菌科的两种菌群，分析反刍动物瘤胃上的定植菌群分布及生物进化动态，为今后畜牧业提高动物代谢能力的研究提供了新思路。

应用亮点：

▶  宏基因组测序发现瘤胃上皮细胞中弯曲杆菌科两个种群的基因序列高度相似，利用naica®微滴芯片数字PCR系统可以对两个种群进行精准量化。

▶ 使用不同培养添加物后，可以利用naica®微滴芯片数字PCR系统进行微生物种群分布跟踪。

研究成果：

作者通过对瘤胃上皮微生物组的16S rRNA扩增子分析发现了一个优势菌株（OTU）为弯曲杆菌科（Campylobacteraceae），并通过宏基因组测序发现该OTU两个主要种群Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi的基因含量高度相似，但pgl（蛋白质糖基化）操纵子不同。

为了探究Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi两个种群空间分布的差异，作者通过naica^®微滴芯片数字PCR系统比较了这两个种群在不同动物瘤胃乳突离上皮壁最近和最远两个位置的含量。结果发现不同动物的两个种群在这两个位置的比例接近。

▲图1 Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突顶端和隐窝的含量比例。A）从乳突切片两个位置提取DNA使用dPCR进行定量分析。B) Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突两个位置的含量比例。横坐标为取样动物的名字。

然后作者使用naica^®微滴芯片数字PCR系统对两种菌群进行生长和适应性测定，数据显示Ca. C. stinkeris可以在以醋酸盐为主要碳源时积累的生物量，更好地生长，但被丙酸盐抑制，而Ca. C. noahiz在任何一种添加物存在的情况下在都没有检测到生长优势。因此，作者推断可能存在一些其他机制来最小化竞争，这种机制通过某些代谢生态位维度上的分化，防止它们生长动力学的重叠来支持两个种群的共存。

▲图2 醋酸盐利用和丙酸盐抗性检测。A)通过种群特异性dPCR，评估添加5 mM醋酸盐（acetate）或丙酸盐（propionate）对生物量积累的影响。分别用单个菌株(左，单一培养)和竞争菌株(右，共培养)进行了实验。

通过数字PCR这种定量技术，作者发现在瘤胃乳突的顶端和隐窝都分布有这两种优势菌群，且与上皮细胞分布数目无显著的相关性。另外，这两种菌群能够促进相关脂肪酸的代谢，进而发挥促进食物消化的功能。该文章为通过调节反刍动物体内某些盐离子浓度来调节优势菌群的分布比例进而提升消化能力提供了思路。

导读

在过去的几十年中，糖尿病的发病率在显著增长。除了不健康的生活方式外，环境污染物被认为是糖尿病发生的危险因素。多环芳烃 (PAH)是一类含有2-7个芳环的有机化合物，由自然和人类活动产生并广泛存在的污染物。流行病学研究表明，PAHs水平与成人和儿童的肥胖和二型糖尿病相关。

厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室的研究人员在Ecotoxicology and Environmental Safety上发表了题为《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中应用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因DNA甲基化水平进行量化，揭示了产前暴露于多环芳烃混合物对成年雄性小鼠胰岛细胞功能的不良影响。

应用亮点：

▶  使用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因启动子甲基化水平进行量化。

▶ 在产前暴露于500µg/kg PAHs的小鼠中，胰岛素编码基因启动子的甲基化水平显著升高。

▶ 产前暴露于PAHs可能促进I型糖尿病的发病。

作者使用8种PAHs的混合物进行了实验，以研究产前PAHs对成年期胰岛细胞功能和质量的影响，同时试图阐明 I型糖尿病发病的环境原因。他们分离了成年雄性小鼠的胰岛，对胰岛素编码基因的启动子DNA甲基化水平进行分析。

研究成果：

▲图1. 产前暴露于多环芳烃对成年雄性小鼠胰岛素编码基因甲基化水平的影响。(A) 数字PCR结果代表性一维图。(B)胰岛素编码基因启动子甲基化水平。(每个处理三只母鼠, 每只母鼠取一个雄性后代) 。

在本研究中，子宫内暴露于500µg/kg PAHs的小鼠胰岛中胰岛素编码基因启动子中的DNA甲基化水平显著增加，同时胰岛素编码基因转录显著下调。

▲图2. 不同PAHs浓度对胰岛素编码基因转录水平的影响

期刊介绍：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977创刊，隶属于爱思唯尔出版集团。是一份多学科交叉期刊，主要研究环境污染对包括人类健康在内的生物体的暴露和影响。最新影响因子为7.129。

naica®六通道数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

导读

除了在蛋白质翻译中的作用外，tRNA可以被切割成较短的生物活性片段，称为tRNA片段（tRFs）。来自精细胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代谢紊乱。因此，种系细胞中的tRFs是表观遗传的一种机制，然而压力和毒素会导致tRFs模式的改变。华盛顿大学妇产科临床研究部的研究人员在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上发表题为《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究对注射类药物（一个重要的压力源）是否会影响生殖细胞中的tRFs感兴趣。研究者对来自注射阿pian类药物病人(PWID)和非药物使用对照组精液来源外泌体及精母细胞进行了RNA测序。测序后采用naica^®微滴芯片数字PCR技术验证数据，该技术的应用为药物滥用相关生育问题的研究提供了新的策略和方法。

阿pian药物滥用对生殖系统的影响一直备受关注。近期一项研究揭示了注射阿pian类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体的变化。该研究通过数字PCR技术检测tRNA-Gly-GCC外泌体，发现未注射阿pian类药物的男性与注射阿pian类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体存在显著差异。

tRNA-Gly-GCC外泌体在精子发生和成熟过程中扮演关键角色。研究结果表明，这些差异可能与精子质量和生育能力的下降有关。naica^®微滴芯片数字PCR技术在本研究中的应用，不仅提供了高灵敏度和高准确性的检测方法，对揭示阿pian类药物对生殖系统的影响具有重要意义。

应用亮点：

▶  naica^®微滴芯片数字PCR技术可以在RNA浓度低于检测下限的样品中检测两种tRFs形式。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR结果与RNA测序结果具有很好的相关性，但比测序具有更高的灵敏度和准确性，有助于深入了解长期使用阿pian类药物的生物学影响。

研究结果：

▲图１.男性长期使用阿pian类药物导致精子中tRF-Gly亚型比例的变化,使用naica^®微滴芯片数字PCR技术定量tRFs。成熟精子细胞通过45-90% Percoll梯度纯化，并使用核苷素试剂盒分离小RNA。cDNA使用一种特定的茎环RT引物与“长”tsRNA亚型（53个核苷酸长）或另一种靶向“短”tsRNA变体（32个核苷酸长）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“长”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（C）“长”与“短”tRF Gly-GCC亚型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的浓度。“C”：对照组（不注射药品的男性）;“PWID”：阿pian药物注射组。P值通过单尾曼-惠特尼U检验计算。对照组：n=10，PWID组：n=13。

研究发现，对照组中超过90%的reads到较短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的读数。相比之下，对照组中只有4.1%的reads到更长的tRF，而PWID为45.6%。PWID的长/短tRF比显著高于对照组。同时发现精液来源的外泌体中小核仁RNA（snoRNA）表达差异。尽管无法确立PWID的发现与阿pian类药物使用之间的直接联系，但研究表明阿pian类药物注射和/或相关多药使用习惯和生活方式改变可能会影响表观遗传。这为阿pian类药物使用的可遗传影响提供了证据，并为进一步研究其跨代健康影响的机制奠定了基础。

数字PCR技术在研究PWID中差异表达的tRFs方面发挥了重要作用。由于精液中含有复杂的细胞混合物，意味着其中含有抑制剂，对于PCR的扩增有很大影响。但数字PCR有抗抑制剂干扰的特点，所以对于这类复杂样本的检测更为适用。文章中数字PCR和测序各自发挥了作用：测序用于发现长tRF和短tRF，而数字PCR则准确检测了tRF片段的表达差异，进而验证了测序的结果。这一发现表明，数字PCR在研究tRFs和其他非编码RNA片段方面具有显著的优势。数字PCR不仅可以在tRFs和其他类似的研究中提供更为精确的结果，还可以在诸如癌症、遗传学和传染病等领域发挥关键作用。

naica^®六通道数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica^®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的juedui拷贝数浓度。

导读

据报道，截至目前两台“奶茶“Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统正式在上海交大落户啦-上海交通大学生物医学工程学院和上海交通大学分析测试ZX，感谢上海交大各位老师们的大力支持，顺利完成安装培训并启用！

不需要标准品可以对低拷贝基因定量，对微小差异的基因进行分析，对含YZ剂的样本进行准确定量等，弥补了二代PCR技术也就是荧光PCR的不足。目前数字PCR技术已经应用在肿瘤学研究、NIPT研究、液态活检、基因编辑、细胞ZL质控、用药及移植监控、致病微生物检测、食品安全、环境检测、核酸类标准物质定量等方面。

此次“奶茶”Naica系统的顺利使用支持其科研团队在分子与纳米医学领域，聚焦重大临床早期诊断和疾病预后等专项科研成果的转化医学研究，攻克关键技术难题，推进 “产学研医”有机结合的科技成果产业化进程。

“奶茶”Naica系统的落户可为核酸定量、生物医学研究、水质检测、食品检测、转基因成分检测、环境污染物分析等多方面检测提供更可靠的平台。

非常感谢用户对我们的平台的认可，同时也希望”奶茶“Naica全自动微滴芯片数字PCR为越来越多的用户检测提供更便捷，更可靠的技术。

更多“奶茶“Naica数字PCR信息可登陆www.cycloudbio.com查看。同时由法国Stilla Technologies公司开发Gene-π作为数字PCR学习交流平台，为您全方位解读数字PCR技术，为用户提供数字PCR技术信息，您也可以选择感兴趣的应用教程，其中包含从实验设计到数据分析的详细工作流程。您还可以通过搜索导航工具直接搜索特定的项目（"dPCR的DNA准备"，"荧光溢出"等），或点击我们的"HOW TO" 选择您需要的部分（设计、分析、报告）。详细信息可登陆网站：https://www.gene-pi.com/查看。

细胞是生物结构和功能的基本单元，在类型和状态上有很大差异。在大多数生物系统中，我们对细胞多样性的认识是不完整的，就像神经系统（脑细胞）这样的复杂组织[1]。单细胞识别和功能的表征，作为对每个细胞的功能和反应的理解，将加速生物领域的发现。它可能是癌症、肿瘤，几何任何可能在细胞群中具有多样性的东西。然而，今天的技术并不能提供一种简单的方法来同时分析大量的单个细胞。快速、可扩展的液滴测序（Drop-Seq）这种方法可以用来表征具有许多细胞类型和状态的复杂组织。

Drop-Seq的原理和好处
Drop-Seq是一种基于使用微流体技术的方法，通过将它们封装在微小液滴中进行平行分析，可以快速分析数千个单个细胞。

这些纳升级水性隔离室已用于微流体器件中的许多应用：纳米颗粒制造、乳液和泡沫、药物输送，但也作为PCR和逆转录的微小反应室[3]。Drop-Seq使用液滴将细胞分隔成纳升大小的反应室，用于分析其mRNA转录物，同时使用分子条形码策略记住转录物的起源细胞。通过这种技术，一个科学家每天可以制作10000个单细胞库，实验并行进行且简单。因此，该方法将允许为已知细胞类别和新的候选细胞亚型产生基因表达的分子图谱。

Drop-Seq利用微流体的优势

（1）很短的时间内有很高的吞吐量

（2）尽量减少昂贵样品的消耗

Drop-Seq包含以下步骤

1. 从组织中制备单细胞悬浮液
2. 准备条形码引物（或者在微颗粒表面或者在内部）
3. 使用微流体装置将每个细胞单独地与一个微小条纹的微粒共同包覆或封装在一个微小的液滴中
4. 一旦分离成液滴，裂解细胞，释放它们的mRNA，然后与引物（primers）杂交。
5. 打破液滴并产生STAMP（附着于微粒的单细胞转录组）
6. 放大STAMP
7. 测试和分析：使用STAMP条形码推断每个转录物的起源细胞

Drop-Seq可以使用2种beads：
A：“简单”的微粒
B：水凝胶微粒

该项工作的ZD是“简单”微粒的使用，并简要介绍了水凝胶微粒，其原理保持不变。

Drop-Seq使用简单的微粒
1. 从复杂的组织中准备单细胞悬浮液
将复杂组织解离成单个细胞

2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每个微粒包含超过108个单独的引物，它们共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“细胞条形码（cell barcode）”，但具有不同的独特分子标识符（UMI）。事实上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，这允许在STAMP形成后进行PCR扩增。细胞条形码，仅在相同微粒的所有引物上相同但与其他beads上的细胞条形码不同，允许回复细胞的起源。每种引物上不同的UMI允许对mRNA转录物进行数字计数并鉴定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕获mRNA并引发逆转录。

细胞条形码的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
为了产生细胞条形码，将微粒库重复分成四个大小相等的寡核苷酸合成反应，向其中加入四个DNA碱基中的一个。然后，在每个循环后将微粒合并在一起，并进行总共12次分裂-池循环（split-pool cycles）。结果是一个微粒库，每个微粒具有4^12（16,777,216）个可能的DNA碱基序列之一。[4]

合成独特的分子标识符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循环完成后进行。将所有微粒一起进行八轮简并合成，每个循环期间可获得所有四种DNA碱基，使得每个单独的引物接受4^8（65,536）种可能序列（UMI）中的一种。[5]

3. 微流体装置
一旦单细胞悬浮液和微粒准备就绪，使用定制设计的微流体装置将单个细胞与微粒一起包覆在液滴中。

Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton

该装置在它们分成离散的液滴之前连接两路水相。层流防止在液滴形成之前混合两种水相输入，一路流相包含细胞，另一路流相包含悬浮在裂解缓冲液中的条形码引物beads。

微流体装置
组件列表
（1）倒置显微镜
（2）压力控制器+3流量传感器/三个注射泵
（3）3个falcon管/3mL注射器
（4）磁力搅拌系统
（5）用于实验装置元件连接的微流体导管
（6）微流体配件和连接器
（7）PDMS共流微流体液滴生成装置
（8）用于beads的100微米细胞过滤器
（9）用于细胞的40微米细胞过滤器
（10）计数室

实验装置连接示意图

4. 细胞裂解和RNA杂交
在液滴形成后，立即将每个细胞在液滴内裂解并释放其mRNA。然后，它们与其伴随的微粒表面上的引物杂交。

5. STAMPS产生
为了一次有效地产生数千个STAMP，通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并收集和洗涤微粒。然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成一组称为“附着于微粒的单细胞转录组（STAMPs）”的beads[6]。

6. STAMPS的放大
然后可以通过PCR反应在池（pools）中扩增条形码化的STAMP，用于高通量mRNA测序，以分析任何所需数量的单个细胞。

7. 测序和分析
使用高容量平行测序对每个末端对得到的分子进行测序。首先，将读数与参考基因组比对以鉴定cDNA的起源基因。接下来，通过细胞条形码组织读数，并且对每个细胞中确定的每个基因的mRNA转录物的数量进行数字计数。这是UMI发挥作用的地方，避免从同一mRNA转录物中重复计数序列读数。随后，可以建立数字基因表达测量矩阵（每个细胞每个基因一个测量）用于进一步的分析。

使用水凝胶微球的Drop-Seq测序
关于水凝胶beads的使用，操作原理或多或少与以上保持相同，即Z大的区别在于引物（primers），它们位于微粒内而不是位于它们的表面上。

为此，微流体装置由三个通道而不是两个通道组成：
（1）带beads的一个通道（Z关键的部分）
（2）把细胞带入液滴的一个通道
（3）带来我们需要进行分析的化学试剂的一个通道

至于“简单微粒（simple microparticles）”的使用，水凝胶beads含有可用于逆转录反应的引物，然后随后对液滴内的细胞内容物进行条形码编码，由此获得作为RNA序列的拷贝的DNA序列的集合，并且现在通过它们来自哪一个液滴来对这些序列进行分类。

然后，可以打破液滴并将整个细胞群作为大量样品处理，知道每个细胞已被单独编码。

相关的资源
开源链接：McCarroll Lab

液滴测序：Droplet-Sequencing

参考论文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.

微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了微流控液滴的动态分析部分如速度场、表面活性剂等知识。

液滴生成油Surf2-DG7500是经过改进后的含PFPE-PEG混合结构的表面活性剂，用于微液滴小球产生的连续油相，呈现电中性，用于稳定分散相和连续相之间的界面，避免液滴内物质的泄露和液滴之间的团聚或堆叠。

液滴生成油Surf2-DG7500是一种液体状态，即开即用，广泛应用于酶反应、3D细胞培养、单细胞包封、单细胞测序、蛋白质结晶、水凝胶合成、DNA合成及液滴微流控与液滴分选等领域。

主要优势如下：

• 油相为氟油7500，具有生物相容性，对细胞没有毒害作用；

• 表面活性剂是PFPE-PEG的混合物

• 可产生10 - 300μm粒径的微液滴

• 具有良好的热稳定性，液滴经高温处理后，没有明显的融合；

• 即开即用

• 提供2%和5%两种浓度

• 后续可继续用氟油7500进行稀释

• 提供10mL和50mL包装