扩增4kb的基因怎么设计引物

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  一只小鸟5711 2011-04-05 00:00:00

  博凌科为-为你解答：如果你是直接从DNA中克隆基因的话，设计一对引物，用高保真的Phusion或者Vent酶就可以。NEB的产品很不错。 如果你要从cDNA中克隆的话，考虑到RNA的降解，你不能使用一对引物来克隆。而是设计两对或者多对引物。比如，你你针对序列这几两对引物，前一对引物的下游，和后一对引物的上游，应该设计15个bp的重合。前一对引物的上游和后一对引物的下游则位于整个4kb基因的首位两段。 这样，你用这两对引物先克隆出4kb基因的两个短片段。然后将两个短片段作为模板，以前一对引物的上游引物，和下一对引物的下游引物来在一个PCR反应体系中扩增，获得4kb的全片段。、 如果你要设计多对引物，方法类似，都是上一段的下游和下一段的上游有十几个bp的重合--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------补充一下，如果你是从基因组中直接克隆的话，那就是设计一对引物。使用高保真的聚合酶做long PCR， 目前的Phusion Taq酶对于4kb的片段是没什么问题的。我自己曾经尝试克隆过3kb的片段，非常的清晰，没有任何拖带。但是成功的关键在于你要设计特异性的引物，建议你设计30-50个bp左右的引物（引物越长，对模板的特异性要求越高），提高退火温度，来保证引物的特异性。 此外，加长PCR程序中的变性时间，来保证基因组DNA的完全接连，适度延长退火时间，加大引物使用的量，来保证引物和模板的结合。毕竟你是从整个基因组中寻找你的目的基因。

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