ELISA 实验的一些原理总结

　　ELISA 实验的一些原理总结

　　ELISA  即酶联免疫吸附测定，是一类常用的免疫酶技术。主要方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，然后利用酶标记(偶联)的抗体或抗原与之孵育，加入显色剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，绘制出酶活曲线得出待测物浓度。

　　ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。ELISA 实验中有三种必要的试剂：

　　① 固相的抗原或抗体(用于结合到固相载体上)

　　② 标记的抗原或抗体(标记物)

　　③ 作用的底物(显色剂，用于显色)

　　四种常见 ELISA方法

　　1. 直接 ELISA

　　将抗原固定于 ELISA 板上，然后用酶标抗体直检测抗原。

　　相较于其它类型的 ELISA 实验，直接 ELISA 实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。但是由于直接  ELISA 的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与 ELISA 板结合，实验背景会比较高。而且直接 ELISA   每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。

　　2. 间接 ELISA

　　先将抗原结合到 ELISA 板上，随后分两步进行检测：先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。

　　与直接 ELISA 相比，间接 ELISA 用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济。间接 ELISA   还提供了更大的灵活性，因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接 ELISA   实验的缺点是存在交叉反应的可能性(酶标二抗直接与抗原结合)，可能会增加背景，同时与直接 ELISA 相比，间接 ELISA   实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。

　　3. 夹心 ELISA

　　先将捕获抗体固定于 ELISA 板孔中，然后加入样品，接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心  ELISA;如果检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心 ELISA。

　　夹心 ELISA 的灵敏度高，它比直接或间接 ELISA 敏感 2-5 倍;同时夹心 ELISA   使用两种特异性抗体与抗原结合，拥有很高的特异性。另外夹心 ELISA 能够通过直接或间接的方式进行检测，灵活性较高。夹心 ELISA   的缺点是对配对抗体要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体，则需要进行配对抗体定制并进行优化，因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。

　　4. 竞争 ELISA 法

　　预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体。实验时，加入待检抗原(或抗体)，如果待检物是抗原，则待检抗原与预先包被在固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体;如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，加底物显色。需要注意的是显色结果与待检抗原(或抗体)的量成反比。

　　竞争 ELISA 相对以上介绍的三种方法更复杂一些，但以上三种 ELISA 类型都适用于竞争 ELISA  的形式。其主要优点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和一性较差的问题。

　　ELISA 常见问题与解决方法

　　1. 阴性对照出现阳性结果

　　① 样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染——更换试剂，小心操作。

　　② 酶标板洗涤不——洗板先将抗体溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔，确保能充分洗涤。

　　③ 抗体量过多导致非特异性结合——根据说明书的推荐量使用抗体，稀释抗体到适当浓度。

　　2.酶标板整体背景高

　　① 抗体非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以防止非特异性结合。

　　② 底物结合浓度过高——对底物进行适当稀释。

　　③ 反应时间过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间。

　　④ 底物溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的，若出现黄色或其他颜色表明受到污染，应更换新的底物溶液。

　　⑤ 底物孵育过程没有避光——底物孵育应在避光条件下进行。

　　3. 复孔之间重复性差

　　① 样品数量不整齐，加样时间有长有短——加重复孔时尽量保持加样时间与接近。

　　② 加样量不一致——样品稀释应充分混匀，并且使用同一移液枪。

　　③ 洗涤条件、操作人员不一致——重复测定样品时，操作条件、人员应尽可能与上次保持一致。

　　4. 吸光值偏高或偏低

　　① 样品中待测抗原含量太低会导致测定结果偏低——可尝试增加样品使用量。

　　② 加入抗体量不合适会造成结果偏低或偏高——使用建议抗体量或为了使结果更好尽可能调整抗体的适用量。

　　③ 孵育时间太短导致检测结果偏低——适当延长抗体或抗原的孵育时间，确保待测样品与检测抗体能充分结合。

　　④ 孵育温度不适合——应抗体在适宜条件下进行孵育(一般 37℃ 孵育 1h )。

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　　ELISA实验原理：ELISA的原理、类型及操作步骤

　　ELISA的原理

　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

　　ELISA方法类型和操作步骤

　　elisa可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

　　(一)双抗体夹心法

　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

　　(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

　　(2)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

　　(3)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

　　(4)加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

　　(二)双位点一步法

　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法测定中，应注意钩状效应(hookeffect)，类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

　　(三)间接法测抗体

　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

　　(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

　　(2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

　　(3)加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接dibiao记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

　　(4)加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

　　(四)竞争法

　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

　　(1)将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

　　(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。

　　(3)加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

　　(五)捕获法测IgM抗体

　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

　　(1)将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

　　(2)加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

　　(3)加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

　　(4)加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

　　(5)加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

　　(六)应用亲和素和生物素的ELISA

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　　elisa实验：怎么保存ELISA试剂盒?

　　(1)要留心避免出现严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因而，在以HRP为符号酶的ELISA试剂盒测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很简单在温育进程中吸附于固相，然后与后边参与的HRP底物反响显色。

　　(2)样本的收集及血清别离中要留心尽量避免细菌污染，一则细菌的成长，其所分泌的一些酶或许会对抗原抗体等蛋白发作分化效果;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作符号的测定方法发作非特异性搅扰。

　　(3)血清标本如是以无菌操作别离，则可以在2～8℃下保存一周，ELISA试剂盒如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长期保存，应在-70℃以下。

　　(4)冰冻保存的血清标本须留心避免因停电等形成的重复冻融。ELISA试剂盒标本的重复冻融所发作的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子发作损坏效果，然后引起假阴性效果。此外，冻融标本的混匀亦应留心，不要进行剧烈振动，重复倒置混匀即可。

　　(5)标本在保存中如出现细菌污染所形成的的混浊或絮状物时，应离心沉积后取上清检测。Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的试验确诊方法。因为其试剂安稳、易保存，操作简洁，效果判断较客观等要素，已广泛应用在免疫学查验的各领域中。ELISA试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗体ELISA检测。成长环境之中的有用因子和营养成分进行更好的了解，确保这种血清原材料的成长活性和可靠性更高，以更加的品质让这种动物细胞培养的活性得到大幅度的提升;

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　　实验干货—ELISA实验过程中的常见问题解答
 

　　ELISA实验中会遇到很多问题，不是这有点小问题，就是那有点小问题，那该怎么办呢?以下便是天津本生技术小编是我们在多年的实验过程中遇到问题的总结：

　　Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色

　　溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定。

　　Q2.标曲和样本均不显色

　　在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱，推荐孵育阶段，使用ELISA用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，结合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

　　Q3.标曲显色，样本不显色

　　当样本中目的蛋白浓度低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目ELISA仍然是蛋白检测灵敏度的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。

　　对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

　　Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大

　　这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大;实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

　　掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。

　　Q5.本底偏高，样本值测不到

　　标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。

　　在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。

　　Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大

　　有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后，计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢?

　　这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抗原抗体的接触，基质效应较明显。而经过稀释后，干扰因素也随之稀释，影响就会较小。当某两个梯度稀释后，计算得到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时，样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本，经过多倍稀释后，就更加测不到了，此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。

　　Q7.不同试剂盒中的组分能否通用

　　除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液，其它组分不建议用其它试剂盒的组分，甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的，如果贸然使用其它试剂盒的组分，有可能对结果产生影响。

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　　人法尼醇X受体elisa试剂盒实验原理及注意事项

　　人法尼醇X受体elisa试剂盒实验原理：

　　本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人法尼醇 X 受体(FXR)水平。用纯化的人法尼醇X  受体(FXR)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入法尼醇 X 受体(FXR)，再与 HRP 标记的法尼醇 X  受体(FXR)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP  酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的法尼醇 X受体(FXR)呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度( OD  值)，通过标准曲线计算样品中人法尼醇 X 受体(FXR)浓度。

　　人法尼醇X受体(FXR)ELISA试剂盒注意事项：

　　1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

　　2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

　　3.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

　　4.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本 OD 值大于标准品孔孔的 OD 值)，请先用样品稀释液稀释定倍数( n  倍)后再测定，计算时请*后乘以总稀释倍数(×n×5)。

　　5.封板膜只限次性使用，以避免交叉污染。

　　6.底物请避光保存。

　　7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

　　8.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

　　9.本试剂不同批号组分不得混用。

　　人法尼醇X受体(FXR)ELISA试剂盒计算：

　　以标准物的浓度为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的

　　OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与 OD 值计算出标

　　准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，

　　即为样品的实际浓度。

　　保存条件及有效期

　　1.试剂盒保存：; 2-8℃。

　　2.有效期： 6 个月

　　人法尼醇X受体(FXR)ELISA试剂盒实验原理及注意事项?先和大介绍到这，如果想要了解更多ELISA的信息，可以关注天津本生生物，业给生物医药客户提供生物实验室检测耗材，欢迎广大客户来询。

　　Elisa实验：Elisa如果加样，有哪些小窍门!

　　ELISA实验中，加样 一定是绕不开的一环!ELISA测定操作非常简单，一般涉及到样本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。

　　ELISA实验中一般需要 4 次加样，即加样本、加检测抗体、加底物和加终止液。

　　● 实验室使用的微量加样器应注意保养并定期校正。ELISA比较敏感，每孔加入液体量误差会导致读数差别，因此避免仪器带来误差。

　　● 加样前，溶液充分混匀，加样时不可90度向孔中滴加液体，否则会导致液体残留在吸头上，加样不准确。正确加样方法应为45度，吸头贴着孔壁和液面的交界处加入。

　　● 加样品时，单孔用量要求：≥50ul/指标，如需要做复孔则所需样本量≥100ul/指标。如果样本量不充足，具体用量可咨询您的专属销售。

　　● 加样时速度不可过快，否则无法保证微量加样的准确性和均一性。

　　● 加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录。

　　● 每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。

　　● 加完显色液后，放入一个可推拉的抽屉内，就可以避光振荡了。

　　| 加样防错小窍门

　　● 用一张写满字的纸，字越多越好，比如报纸，垫在下面，这样，加过标本的小孔看过去下面的字会变小，没加的字正常，非常容易区分。

　　● 可以利用液面反光与没有加的孔加以区别。

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