为什么能在细菌破碎后的细菌提取液中分离到质粒DNA

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  wk146987 2010-11-14 00:00:00

  分子克隆技术（华农） 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是Z常用、Z基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。 实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验步骤： 1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养； 2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养； 3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 4. 加入300 ml溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； （剧烈） 5. 加入300 ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟； 6. 加入300 ml溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和） 7. 12000 g离心10分钟； 8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟； 9. 12000 g 常温离心15分钟； 10. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）； 11. 室温放置或超净台上风干DNA； 12. 加40 ml灭菌超纯水或TE溶解； 13. 质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。 附注：质粒检测 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为Z佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA

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  hour丿寻寻幂幂 2010-11-02 00:00:00

  1.质粒本质就是cccDNA，存在于细胞质中，即细胞“质”中的“粒”子，质粒。 2.质粒要从细菌中释放，细菌细胞壁和细胞膜必须破碎。 3.细菌细胞壁和膜一旦破裂，质粒必定释放出来。因此可以分离的到质粒。 这似乎很合乎逻辑 没什么问题的哦

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  First星曦十月 2010-11-01 00:00:00

  细菌破碎后质粒中DNA就会因为质粒被破碎而进入到提取液中

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  jmbmbmbmbm 2010-11-01 00:00:00

  首先要知道，质粒是 共价，闭合，环状的DNA（cccDNA）。以常用的碱裂解法为例： 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒的cccDNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，而其他形式存在的DNA则会依然以絮状形式存在；离心时质粒DNA留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

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