微生物实验时磷酸盐缓冲液和磷酸盐稀释液一样吗

Tris和磷酸盐都是很常用的缓冲液，它们有相同的地方也有很多不同的地方，如何能在使用时正确分辨和选择，这也是难倒了一批人。我们今天就先从它们各自的应用及使用环境讲起。让你能很直观的感受到它们的区别。

Tris缓冲液

在电泳缓冲液中同甘氨酸构成缓冲体系稳定pH值；在凝胶中使用Tris-HCl缓冲体系稳定pH值；被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂；Tris缓冲液的低离子强度特点还可用于线虫的中间纤维的形成；在Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，可用于DNA的稳定和存储；将调节pH值的酸溶液换成乙酸，获得“TAE缓冲液”，换成硼酸可获得TBE缓冲液。这两种缓冲液常用于核酸电泳实验中。

磷酸盐缓冲液

一般的有活性的生物制剂都要用磷酸盐缓冲溶液来稀释。原因就是它具有盐平衡、可调整适宜pH值的缓冲作用。蒸馏水不具有盐平衡作用，会破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是先选。当然，有的生物活性物质需要的条件比较高，就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分，维持合适的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性。因此PBS主要用于细胞实验，其缓冲范围最适宜在中性（7.0）。

在生物化学实验中要慎重地选择缓冲溶液，不仅要考虑缓冲液的缓冲范围，还要综合考虑缓冲液的使用环境：

1. 磷酸盐缓冲溶液的缓冲范围比较宽，但是它在pH7.5以上时缓冲能力很小；Tris本身呈碱性，可以只用Tris-HCl缓冲体系即可配制pH范围由酸性到碱性的缓冲液，方法也较为简单，对于不同的实验，Tris还可以与其他物质组成多种缓冲体系。

2. 磷酸盐缓冲溶液易与常见的Ca2+离子、Mg2+离子以及重金属离子缔合生成沉淀，同时会抑zhi某些生物化学过程以及多数酶的活性，包括激酶，磷酸化酶，脱氢酶等；相比之下Tris缓冲溶液对生物化学过程干扰很小，也不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。若反应体系中存在金属离子或者酶制剂，则以Tris缓冲溶液为较优选择。

3. Tris缓冲液的pH值受溶液浓度影响较磷酸盐缓冲溶液大，同样稀释十倍，磷酸盐缓冲溶液的pH值变化小于0.1，而Tris缓冲液的pH值变化则大于0.1。因此对于体积变化较大的反应体系，则应慎重使用Tris 缓冲液。

4. 另外，Tris缓冲溶液受环境影响较大。一般来说，温度每升高一度，pH值下降0.03； 同时其易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。

如何选择缓冲剂？

选择缓冲体系，其解离常数pKa值应该在设定的pH上下一个pH值单位内，因为缓冲液的pKa变化超过一个pH单位时，其缓冲能力就会明显下降；

缓冲体系不应影响蛋白质的活性或者DNA的稳定性，并避免其他离子的干扰；

另外，还要考虑温度的影响：温度不仅对缓冲液有影响，对细胞也有影响，大多数动物细胞在37℃的生理状况下pH为7.0~7.5，而在温度下降到0℃时可达到8.0。

一、磷酸盐缓冲液的优缺点：

是使用很广泛的一种缓冲剂，由于它有二级解离，所以缓冲的pH值范围很广，可配置各种pH值的酸性、碱性和中性缓冲液。

优点：

易配成各种浓度

适用pH范围宽

pH受温度影响小

稀释后pH变化小

缺点：

易与常见的钙离子、镁离子及重金属离子缔合成沉淀。

二、Tris缓冲液的优缺点：

Tris缓冲液是在生物化学研究中使用较广泛的一种缓冲剂，其本身为弱碱，常用有效pH在“中性”范围。

优点：

碱性较强，可以只用这一种缓冲液配置由酸到碱的但范围pH缓冲液；

对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀；

易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封；

此缓冲液对某些pH电极发生一定干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。

缺点：

pH受浓度影响较大，稀释10倍，pH变化大于0.1

温度效应大，如4℃时pH=8.4，37℃时pH=7.4

三、HEPES缓冲液的优缺点：

HEPES是一种非离子两性缓冲液，其在pH7.2~7.4范围内具有较好的缓冲能力，常用在生化诊断试剂盒、DNA/RNA提取试剂盒及PCR诊断试剂盒里。

优点：

在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值，并对细胞无毒性作用。

缺点：

在高浓度时对一些细胞可能有毒，与其他缓冲剂相比价格略贵。

四、PIPES缓冲液的优缺点：

PIPES是哌嗪缓冲液家族的一员，与HEPES属于同一家族。它是两性离子Good's缓冲液，在6.1至7.5的pH范围内有效。由于pH范围与HEPES略有不同，PIPES的浓度仅为HEPES浓度的一半。

优点：

该缓冲剂不会与金属络合，因此可用于含金属离子的溶液；

可以用于色谱分析，电子显微镜固定植物细胞，以及代替草甘膦缓冲液。

缺点：

当溶液的pH值升高到6.5以上时，PIPES的游离酸才容易溶解，但是PIPES的钠盐很容易溶解；

如果使用的是游离酸形式的缓冲液，请使用氢氧化钠将其转化为钠盐，以提高在较低pH下的溶解度；

像HEPES一样，PIPES不适用于涉及氧化还原反应的实验，因为它会导致自由基的形成。