我用ELISA法测TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10，如何包被板

　　肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒

　　仅供体外研究使用

　　本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠(Acetyl-Foxo3a)的含量。

　　有效期：6个月

　　保存条件：2-8℃

　　[实验原理]

　　试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被肿瘤坏死因子α捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成ZZ的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α呈正相关。用酶标仪在450nm  波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度。

　　[样本处理及要求]

　　1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20  分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃  1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M,   pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶YZ剂)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

　　4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　注：标本溶血会影响检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

　　[需要而未提供的试剂和器材]

　　1.酶标仪(450nm)

　　2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　3.37℃恒温箱

　　4.蒸馏水或去离子水

　　[试剂盒组成]

　　1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 ; 2 酶标试剂 6ml×1 瓶

　　3 酶标包被板 12 孔×8 条 ; 4 样品稀释液 6ml×1 瓶

　　5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 ; 6 显色剂B 液 6ml×1/瓶

　　7 终止液 6ml×1 瓶; 8 标准品(48ng/ml) 0.5ml×1 瓶

　　9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶; 10 说明书 1 份

　　11 封板膜 2 张; 12 密封袋 1 个

　　肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒 【备注】：

　　1. 标准品浓度依次为：600、300、150、75、37.5、18.75 ng/mL

　　2.  经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

　　[注意事项]

　　1.严格按照规定的时间和温度进行温育以准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

　　2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

　　3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

　　4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

　　5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

　　6.在储存和温育时避免强光直接照射。

　　7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

　　8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

　　9.不能使用过期产品。

　　10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

　　[试剂准备]

　　试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

　　20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

　　[操作步骤]

　　1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

　　2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

　　3. 样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。

　　4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

　　5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

　　6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　7. 每孔加入终止液50μL，15min内，大鼠(Acetyl-Foxo3a)试剂盒在450nm波长处测定各孔的OD值。

　　[实验结果计算]

　　以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度值。

　　(此图仅供参考)

　　肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒[性能]

　　1. 检测范围：18.75 ng/mL – 600 ng/mL。

　　2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 ng/mL。

　　3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

　　4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

　　elisa出现全板空白的原因

　　ELISA实验中出现全板空白的原因主要包括以下几个方面：

　　试剂问题：试剂盒在运输、保存期间放置的温度过高，时间过长，导致抗原、抗体效价下降，酶的活力降低;试剂盒已经超出保存的有效期，抗原抗体效价下降，酶的活性降低。‌

　　操作问题：漏加或者误加试剂，如忘记加酶、忘记加显色液、酶或显色液污染失效等。‌

　　样本问题：样本存在内源性干扰物质，样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染等。‌

　　设备问题：洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶物;洗涤液配制有误等。具体原因分析：

　　试剂问题：试剂盒在运输、保存期间放置的温度过高，时间过长，导致抗原、抗体效价下降，酶的活力降低;试剂盒已经超出保存的有效期，抗原抗体效价下降，酶的活性降低。

　　操作问题：漏加或者误加试剂，如忘记加酶、忘记加显色液、酶或显色液污染失效等。

　　样本问题：样本存在内源性干扰物质，样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染等。设备问题：洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶抑制物;洗涤液配制有误等。

　　解决方法：

　　检查试剂：确保试剂在有效期内使用，避免高温存放;检查试剂是否有过期或失效的情况。‌13规范操作：严格按照操作规程进行，避免漏加或误加试剂;每次加液前核对标签，确保无误。

　　处理样本：避免样本溶血、污染、过久储存等现象;检查样本中是否存在内源性干扰物质。

　　设备检查：使用干净的器皿配制试剂，确保洗涤液正确配制;校正温育箱温度，确保温育时间和温度足够。