干货丨色谱样品分析前处理中的衍生化技术

在色谱分析检测中（GC&HPLC），我们经常要使用到衍生化技术手段来达到对目标物质的定性定量分析，按照衍生化发生在色谱分析前后，分为柱前衍生和柱后衍生，今天我们就和小编一起学习衍生化目的、原理、分类和应用等。

一、衍生化的目的

衍生化包括分析物与衍生化试剂之间发生的化学反应，其目的是改变该分析物的理化性质，主要有以下几个目的：

➤提高检测性能

➤改变分析物的分子结构或极性以获得更出色的色谱分离

➤增加挥发性

➤改变基质性质以实现更好的分离

➤稳定分析物

二、常用的衍生化试剂

1.硅烷化试剂

•硅烷基指三甲基硅烷Si(CH₃)₃或称TMS；

•硅烷化作用是指将硅烷基引入到分子中，一般是取代活性氢；

•活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性，增强了挥发性和稳定性；

•对于不挥发或者200-300℃的稳定性，可以使用硅烷化试剂衍生；

•硅烷化试剂容易吸潮失效，因此在使用过程中需要对样品和试剂脱水。

2.酰基化衍生试剂

•酰基化能降低羟基、氨基、巯基的极性，减小色谱峰拖尾，增强挥发性；

•能增强某些容易氧化的化合物（如：儿茶酚胺）的稳定性；

•引入含有卤离子的酰基，可以提高电子捕获检测器（ECD）的灵敏度。

3.紫外衍生试剂

紫外衍生化试剂主要是给一些没有紫外吸收或者紫外吸收很弱的化合物分子引入强紫外吸收的基团，使得目标物能被紫外检测器检测。

4.荧光衍生化试剂

液相色谱检测中荧光检测器的灵敏度要比紫外检测的灵敏度高出几个数量级，但是大多数化合物没有荧光，通过荧光衍生化试剂将目标物上接上能发出荧光的生色基团，以达到荧光检测的目的，由于荧光衍生物的激发波长与发射波长与衍生化试剂不同，即使衍生化试剂过量或者有副反应，也不干扰荧光衍生物的检测。

5.电化学衍生化试剂

电化学检测器（ECD）是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的，在液相色谱中常用来检测无紫外和无荧光的，但是有电活性的化合物，其检测灵敏度高，选择性强，对于没有电活性的化合物，与电化学衍生试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物就可以使用ECD检测，由于硝基具有电化学活性，因此常用来作为电化学衍生试剂，常见电化学衍生试剂化如下：

三、衍生化在HPLC及GC中的应用案例分享

HPLC中的应用案例-氨基甲酸酯农药检测（GB23200.112-2018）

甲奈威和克百威属于氨基甲酸酯一类的广谱杀虫剂，常用于水稻和玉米作物，其本身无荧光，通过高温碱性条件下，将其水解为甲基胺，再与邻苯二甲醛(OPA) 和2-巯基乙醇(RSH) 反应，生成具有强荧光性的异吲哚衍生物，可用于荧光检测，检测级别可到达ppt级别。

GB23200.112-2018中9种氨基甲酸酯类农药及其代谢物的柱后衍生谱图

GC中的应用案例-氯丙醇及其脂肪酸脂的检测（GB5009.191-2016）：

酰基化能降低羟基、氨基、巯基的极性，改善这些化合物的色谱性能（减少峰拖尾），并能提高这些化合物的挥发性，也能增强某些容易氧化的化合物的稳定性，当酰基化时引入了含有卤素离子的酰基时，还能提高使用ECD检测的灵敏度。

GBGB5009.191-2016中，采用七氟丁酰咪唑作为衍生化试剂，在温和的条件下将羟基钝化反应生成具较好稳定性、良好挥发性和强电负性的衍生物，并使用GCMS检测。

       在色谱分析检测中（GC&HPLC），我们经常要使用到衍生化技术手段来达到对目标物质的定性定量分析，按照衍生化发生在色谱分析前后，分为柱前衍生和柱后衍生，今天我们就和小编一起学习衍生化目的、原理、分类和应用等。

一、衍生化的目的

       衍生化包括分析物与衍生化试剂之间发生的化学反应，其目的是改变该分析物的理化性质，主要有以下几个目的：

       ➤提高检测性能

       ➤改变分析物的分子结构或极性以获得更出色的色谱分离

       ➤增加挥发性

       ➤改变基质性质以实现更好的分离

       ➤稳定分析物

二、常用的衍生化试剂


1.硅烷化试剂

•硅烷基指三甲基硅烷Si(CH3)3或称TMS；

•硅烷化作用是指将硅烷基引入到分子中，一般是取代活性氢；

•活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性，增强了挥发性和稳定性；

•对于不挥发或者200-300℃的稳定性，可以使用硅烷化试剂衍生；

•硅烷化试剂容易吸潮失效，因此在使用过程中需要对样品和试剂脱水。

2.酰基化衍生试剂

•酰基化能降低羟基、氨基、巯基的极性，减小色谱峰拖尾，增强挥发性；

•能增强某些容易氧化的化合物（如：儿茶酚胺）的稳定性；

•引入含有卤离子的酰基，可以提高电子捕获检测器（ECD）的灵敏度。

3.紫外衍生试剂

       紫外衍生化试剂主要是给一些没有紫外吸收或者紫外吸收很弱的化合物分子引入强紫外吸收的基团，使得目标物能被紫外检测器检测。

4.荧光衍生化试剂

       液相色谱检测中荧光检测器的灵敏度要比紫外检测的灵敏度高出几个数量级，但是大多数化合物没有荧光，通过荧光衍生化试剂将目标物上接上能发出荧光的生色基团，以达到荧光检测的目的，由于荧光衍生物的激发波长与发射波长与衍生化试剂不同，即使衍生化试剂过量或者有副反应，也不干扰荧光衍生物的检测。

5.电化学衍生化试剂

       电化学检测器（ECD）是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的，在液相色谱中常用来检测无紫外和无荧光的，但是有电活性的化合物，其检测灵敏度高，选择性强，对于没有电活性的化合物，与电化学衍生试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物就可以使用ECD检测，由于硝基具有电化学活性，因此常用来作为电化学衍生试剂，常见电化学衍生试剂化如下：

三、衍生化在HPLC及GC中的应用案例分享

HPLC中的应用案例-氨基甲酸酯农药检测（GB23200.112-2018）

       甲奈威和克百威属于氨基甲酸酯一类的广谱杀虫剂，常用于水稻和玉米作物，其本身无荧光，通过高温碱性条件下，将其水解为甲基胺，再与邻苯二甲醛(OPA) 和2-巯基乙醇(RSH) 反应，生成具有强荧光性的异吲哚衍生物，可用于荧光检测，检测级别可到达ppt级别。

GB23200.112-2018中9种氨基甲酸酯类农药及其代谢物的柱后衍生谱图

       GC中的应用案例-氯丙醇及其脂肪酸脂的检测（GB5009.191-2016）：

       酰基化能降低羟基、氨基、巯基的极性，改善这些化合物的色谱性能（减少峰拖尾），并能提高这些化合物的挥发性，也能增强某些容易氧化的化合物的稳定性，当酰基化时引入了含有卤素离子的酰基时，还能提高使用ECD检测的灵敏度。

       GBGB5009.191-2016中，采用七氟丁酰咪唑作为衍生化试剂，在温和的条件下将羟基钝化反应生成具较好稳定性、良好挥发性和强电负性的衍生物，并使用GCMS检测。

体积排阻色谱SEC在样品前处理中，有着独特的作用，今天小编就带您一起探寻一下GPC的原理，以及它在样品前处理中的出色应用，一起来学习吧！

1.定义

体积排阻色谱法（Size exclusion chromatography，SEC）是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，它又称为空间排阻色谱法（Steric exclusion chromatography）。

2.分类

流动相：水；凝胶过滤色谱（GFC）

流动相：有机相； 凝胶渗透色谱（GPC）

3.固定相

填料：多孔凝胶（软性凝胶和刚性凝胶）；

特点1：表面分布大小不一的小孔（如图）

特点2：凝胶颗粒间存在空隙

4.分离

特点1：

化合物按照分子量大小，分为小分子，中等分子、大分子。

小分子： 能通过小孔、中孔、大孔、空隙；

中等分子：能通过中孔、大孔、空隙；

大分子： 被排阻在外，只能通过填料空隙。

特点2：

分子量越小，越能通过更多不同的孔径的孔，分子量越大，只能通过一些较大孔径的孔，分子量足够大完全被排斥在外，而不能通过孔，只能通过填料间的空隙。

特点3：

能通过的孔越多，所走的距离越长，出峰越慢；能通过的孔越少，所走的距离越短出峰越快。

5.原理

基于分配理论：

6.确定分子量大小

如同色谱质谱的定量分析一样，通过标准曲线法来定量未知样品的分析物质的浓度。在GPC中组分从柱中的洗脱体积（Ve）与分子量（M）存在对应关系lgM- Ve，我们可先通过配置好的已知分子量的化合物分子，进样后，在凝胶柱上存在对应的洗脱体积，来配制标准曲线，在相同色谱条件下，未知的物的分子量，可以通过其洗脱体积，在准曲线上找到对应的分子量。

A: 分子量为10⁶， 对应洗脱体积为V₀

B：分子量为10³ , 对应洗脱体积为V₀+V_P

X: 未知物，对应的洗脱体积为V_x， 可求得其分子量大小

7.两个极限

极限一：排阻极限

如果要分离的物质，分子量足够大，比填料的ZD孔径都大，所有分子都将被排斥。

极限二：渗透极限

如果要分离的物质，分子量足够小，比填料的最小孔径都小，所有分子都被渗透。

结论：体积排阻色谱只能分离凝胶柱处于渗透极限对应化合物分子量A和处于排阻极限对应化合物分子量B之间的物质。

8.举个例子（土壤中的多环芳烃的分离）

图中的蓝色为为土壤萃取物的紫外吸收曲线，可以发现，色谱峰型较宽，只出现一个混杂的色谱峰，如不处理，将难以进行定量分析，黑色线为经过SEC处理的土壤提取物，当得知多环芳烃流出的时间后（收集点），在其流出时间处收集（红色部位），将收集物在反相液相色谱上分析，得到如下色谱图：

经过SEC处理的收集物（多环芳烃），在HPLC上 得到了好的分离，干扰性杂质（玉米油、DEHP等）也得到了很好的去除效果。另外GPC得一个典型的应用，就是在农药残留分析中，去除油脂，大分子蛋白、色素。SEC提供了常规SPE和LLE难以分离处理的复杂基质样品的前处理手段。

卡尔费休法是1935年由Karl Fischer提出的测定水分的分析方法，适用于测定所有类型的物质：化学品、油品、药品和食品等等。目前卡尔费休滴定法已经发展成为世界性广泛使用的一种水分分析方法。

对于一些难测样品，我们经常会觉得无从下手，今天就给大家带来复杂样品中的卡尔费休水分检测。

难溶样品

在日常样品的水分检测时，经常会遇到一些样品很难溶解或者溶解性较差而导致无法准确的测得样品水分含量。通常遇到难溶样品，我们可以采用加入助溶剂来提高样品的溶解性，进一步测得样品中的水含量。

如何选择一款合适的助溶剂？

1.不会与KF试剂产生副反应；

2.不会YZKF反应速度；

3.助溶剂水含量较低；

4.大大增加样品的溶解性，使样品充分溶解；

氯仿：

可以提高长链羧酸、醚、烃类的溶解性，适合脂肪、油类、长链烃等在甲醇溶剂中溶解性比较差的样品。

1-己醇（1-戊醇等长链醇）：

可以增加长链羧酸、醚、烃类的溶解性。

甲酰胺：

1.提高甲醇中极性物质的溶解性；

2.有助于提高糖类、蛋白质和无机盐等的溶解性；

3.可以提高KF反应速度；

4.不适用于库仑法有隔膜体系。

会产生副反应的样品

在检测醛酮、苯胺、硅醇、过氧化物、酚类、青霉素等等样品时，无法测得其中的水分含量，经常会发生滴定无法到达终点、滴定时间过长、过滴定等问题，问题发生的原因就在于这些样品很容易与KF试剂中的组分（甲醇、二氧化硫、碘）发生副反应。

解决方案：

1.醛酮类样品

可以采取无甲醛体系的醛酮专用KF试剂，适用于可能会与甲醇发生副反应的样品；

2.调节KF反应系统的pH

KF反应ZJpH为5-7，可以通过调节pH来YZ副反应，pH越低，KF反应速度下降，同时YZ了副反应，可以通过向KF反应池中添加苯甲酸或水杨酸来实现；

3.降低KF反应系统的温度

温度降低可以有效YZ副反应的产生，而KF反应可以顺利缓慢进行；

4.使用卡式炉

卡式炉可以避免样品与KF试剂直接接触，从而避免副反应产生。

过酸过碱样品

KF反应的ZJpH为5-7。pH值过高，会产生副反应，副反应会消耗一定量的碘，使碘和水不是按照1：1的比例进行反应；pH值过低，会使KF反应常数下降，导致反应速度变慢。

因此，当遇到强酸或者强碱性样品时，会使KF反应体系pH值偏小或偏大，此时需要向系统中添加弱碱（咪唑）或弱酸（水杨酸、苯甲酸等）等来保持反应体系pH保持在5-7之间，以达到KF反应的ZJ速率。

pH的测定：使用玻璃注射器从反应池中取出一部分工作介质，可以用玻璃电极测pH值，也可以直接使用pH试纸测定。

冻干粉样品

冻干粉样品通常很容易吸收空气中的水分，导致水分含量过高。因此，通常需要将冻干粉样品直接溶解，避免接触空气的情况下转移至滴定池中，进行水分测试。

对于冻干粉样品可以选择以下三种方式进行水分测定：

1.用带长针头的玻璃注射器吸取KF溶剂，注入到含样品的密封样品瓶中，充分溶解后加入到KF反应池中进行测定；

2.用带长针头的玻璃注射器吸取已经预滴定的KF反应池中溶液，通过冻干塞子注入样品瓶中，样品充分溶解后，用注射器将整个溶液注入到滴定杯中进行测定；

3.采用卡式炉进行测定。

本章主要提供关于湿法测量和干法测量样品准备的信息。

概述
  在粒度测试前样品的准备是很重要的，测量中遇到的多数问题是由样品准备不充分引起的，比如样品结块、溶解、浮在表面或没得到典型样品，结果就会出现错误。因此要找到有效的方法来确保样品充分准备。一旦找到了合适的分散技术，那么就要规范程序，以便对两种样品进行比较。
典型抽样
  测量提取样品时，要确保使用的样品是有代表性的。如果是从瓶子或容器中提取的样品，必须保证样品是充分混匀的，如果样品是粉状，大颗粒易浮于容器表面，小颗粒易沉于底部。
大多数样品都会有一些大颗粒，还会有一些小颗粒，但是大多数在两个极端中间，从容器表面提取样品，测量的大多是大颗粒，如果和从容器中间提取的样品来对比测量，结果会明显不同。
  如果样品储存在容器中，测量前样品应充分混合。不要摇晃容器，这样会加速颗粒分离。相反，用两只手握着容器，轻轻滚转，不停更换方向20秒，当容器是半满时，这种方法会更好。液体样品存在容器中也可能被分离，大颗粒沉入底部。提取典型样品应将样品充分混合。应当注意磁性搅拌器混合液体样品时，由于离心分离，大颗粒易移到容器外面，这易导致样品偏差。

干样品应注意的问题
    首次测量样品的*步就是决定在湿状态下还是在干状态下分析样品。这是由*终使用什么样品来决定的。如果以干燥形势来使用或储存样品，用干燥分析方法较好。
  一些样品易和湿分散剂起反应，比如可能溶解或和液体接触时膨胀，所以只能在干燥状态下测量。
  另一考虑问题就是物质在干燥状态能否自由流动，良好的表现为不粘连干燥粉状样品，可以在进料器中充分分解，而高粘性物质却易粘结，使测量出现偏差。
  样品结块只需要在烘箱中干燥一下即可。但精细的物质在烘箱中干燥时，样品会受到破坏，为了去潮，应将烘箱调到*温度，但不要高于样品熔点。
  如果烘箱对样品有明显影响，可用干燥器。没有在空气中受潮的新样品是很好用的，常有很好的效果。吸潮样品应将样品尽快封装入袋，以免吸潮。

湿样品应注意的问题
    以上考虑的问题是分析干燥样品，在湿状态下分析样品时更应小心，因为有更多选择，这一章的后面部分是湿样品准备时应注意的问题。

分散剂的选择和准备
  *个选择是测量湿样品时对悬浮介质（分散剂）的选择。初次分析样品时*预先检查分散情况，将选择好的分散剂（初期测量通常用水）加入装有少许样品的烧杯中并观察结果。样品可能溶解，这可以观察到，如果不确定，可以对样品进行分析并观察遮光度，如果观察到遮光度降低，说明样品正在溶解。如果分散剂自身含有杂质或颗粒，这是值得注意的。测量后安全处理样品的问题也必须考虑，遵照当地政策并采用正确的程序来处理样品和分散剂，大多地方法规都禁止危险的样品和分散剂排放到水域中去。

表面活化剂和混合剂

  当遇到像样品飘浮在分散剂表面这样的问题时，加入表面活化剂和混合剂是有用的，下一部分简要地解释这种添加物的用处。

表面活化剂
  添加表面活化剂可帮助样品准备，表面活化剂可以转移掉作用于样品使样品浮于表面或结团的电荷效应。用少量添加法来添加活化剂，标准是每升一滴。如果加入太多，搅拌或抽取样品时会产生泡沫，在系统中泡沫可能被看作颗粒，这会影响测试结果。

超声波使用
  除了上述过程外，无论是否含有表面活化剂都可以用超声波来帮助分散。在悬浮介质中混合样品时，可以用肉眼观察是否需要超声波。如果烧杯底部有大量颗粒结块，将装有样品的烧杯放入超声波槽里分散两分钟，效果会非常明显。如果需要，当样品加入样品池时也可以使用超声波，这将阻止重新结块。

注意
  对易碎颗粒使用超声波时要小心，因为超声波可能会使颗粒分离。如果对使用超声波前后的效果有疑义，则可用显微镜进行观测。

展会回顾

SPC2023 云南省样品前处理创新大会

2023年8月4日，SPC2023云南省样品前处理技术创新大会云南昆明圆满落幕，本次大会以“样品前处理创新理念”为主题，邀请了来自全国的前处理领域研究专家，质检、食品、环监、疾控、生物医药等监管、检测机构以及高校、科研院所等分析测试管理者及技术人员。

ASHMAR作为实验室前处理设备生产商受邀参加本次大会，在会议现场展示了我们的设备，并与行业人员共同交流探讨了实验室前处理过程中遇到的相关问题以及实验室前处理设备解决方案，受到了广泛认可。

大会议程

关于我们

ASHMAR在现场

现场照片

产品介绍

全自动固相萃取仪QuickTrace S系列

QuickTrace S系列全自动固相萃取仪，采用固相萃取技术，利用固体吸附剂有选择性将样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰物分离。它主要的功能是对样品进行富集和净化。仪器运行过程，全自动化无人值守、机械式重复运行模式流、流量精确控制。结构紧密，可以完全放置于通风柜内，避免运行过程中产生的溶剂蒸汽散发到工作环境中，危害实验人员的身体健康。

以用户为导向的设计特点

● 透明窗口创造性实现了样品萃取过程的可视性

● 大尺寸屏幕、照明系统方便用户查看以及操作

● 主机配屏幕操控、PC有线操控、PC无线操控等多种方式操作

● 具有即插式进气口、即插式排废口等特点

灵活的配置

● 多种通道满足不同应用

● 多种试管架和样品管配置

● 0.6ml-20L上样体积配置

● 适配VortexVap/FSE/VacuuoVap等仪器

《干货丨样品称量准确度影响——温度篇》里针对电子天平准确度的影响，我们从环境因素分析温度对样品称量准确度的影响。这期我们将继续从环境因素分析静电作用对样品称量准确度的影响。

静电现象在我们的日常生产、生活中无处不在。若称量容器上带有静电，会导致电子天平的显示值长时间波动，无法稳定显示准确的称量结果，影响样品称量准确度。在称量过程中，经过摩擦的称量样品、称量容器及实验人员的衣物上等都可能带有静电。而且，样品的带电量也会随着实验人员的具体操作以及实验人员与电子天平之间距离的远近而变化。如：对没有静电屏蔽功能的电子天平加载、卸载称量样品的操作和与秤盘或桌面的接触，样品的带电量都会实时发生变化，看似完全相同的操作，却毫无规律可言；实验人员身上所带的静电，随着实验人员身体距离天平的远近变化，也会造成数值的变化，使得样品称量准确度受到影响。

如何避免静电对称量准确度的影响？

1 控制称量环境湿度在40% - 70%之间

在这个湿度范围内，物体表面会形成一层极微薄的导电水层，使其电阻率大大降低，电荷快速转移，静电作用减弱；

2 称量容器尽量选用金属或玻璃材质

避免使用塑料材质的称量容器。塑料常规情况都是绝缘体，电荷集聚在其表面无法流动就变成了静电聚集体，使得静电作用增强；

3 电子天平安装专门的消除静电装置

安装专门的消除静电装置并将秤盘接地，可以有效降低静电作用；

4 zui好穿着棉质实验服或防静电面料的衣物

操作人员在做称量的过程中，zui好穿着棉质实验服或防静电面料的衣物，必要时操作人员同时带防静电手环，避免因为人员移动而产生静电。

实验室样品称量操作中影响准确度的因素有很多，其中静电是不容小觑的一个因素。针对上述分析静电产生的原因及应对措施，可以有效减少静电作用对称量操作的影响，提高称量准确度。

对于ICP-OES和ICP-MS的样品分析，样品前处理对结果的影响与仪器一样重要，钢研纳克在提供专业分析仪器的同时，也提供专业的实验室应用解决方案，本文为广大实验室工作者整理了前处理实验中会遇到的知识点和注意事项，干货满满，速速收藏！