Electroanalytical properties of cytochrome c by dire

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小鼠细胞色素C（Cytochrome C）ELISA试剂盒

小鼠细胞色素C（CytochromeC）ELISA试剂盒原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠CytochromeC单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的CytochromeC与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠CytochromeC，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液，在450nm处测OD值，CytochromeC浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中CytochromeC浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：2ng/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。2.标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成4000pg/ml的溶液。设标准管8管，每管加入标本稀释液200ul。在**管中加入4000pg/ml的标准品溶液200ul混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出200ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）标本激活方法1.将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。2.加20ul1NHCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60±2分钟。3.加20ul1NNaOH,盖紧，上下混匀。4.即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。（注意：不同的标本CytochromeC的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）5.细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释（410ul的标本稀释液＋50ul样本＋20ul的1NHCI+20ul的1NNaOH）。检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应CytochromeC含量，再乘上稀释倍数即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的CytochromeC检测浓度小于15pg/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的小鼠CytochromeC。不与小鼠其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]
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小鼠细胞色素C（Cytochrome C）ELISA试剂盒说明书

小鼠细胞色素C（CytochromeC）ELISA试剂盒原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠CytochromeC单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的CytochromeC与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠CytochromeC，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液，在450nm处测OD值，CytochromeC浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中CytochromeC浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：2ng/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。2.标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成4000pg/ml的溶液。设标准管8管，每管加入标本稀释液200ul。在**管中加入4000pg/ml的标准品溶液200ul混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出200ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）标本激活方法1.将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。2.加20ul1NHCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60±2分钟。3.加20ul1NNaOH,盖紧，上下混匀。4.即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。（注意：不同的标本CytochromeC的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）5.细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释（410ul的标本稀释液＋50ul样本＋20ul的1NHCI+20ul的1NNaOH）。检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应CytochromeC含量，再乘上稀释倍数即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的CytochromeC检测浓度小于15pg/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的小鼠CytochromeC。不与小鼠其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]
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大鼠细胞色素C（Cytochrome C）ELISA试剂盒说明书

电话：021-6533363955229872网址：http://www.westang.com大鼠细胞色素C（CytochromeC）ELISA试剂盒原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠CytochromeC单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的CytochromeC与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠CytochromeC，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，CytochromeC浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中CytochromeC浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：20ng/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，**管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应CytochromeC含量即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的CytochromeC检测浓度小于15pg/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的大鼠CytochromeC。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]
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人细胞色素C（Cytochrome C）ELISA试剂盒说明书

人细胞色素C（CytochromeC）ELISA试剂盒原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人CytochromeC单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的CytochromeC与单抗结合，加入生物素化的抗人CytochromeC，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液，在450nm处测OD值，CytochromeC浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中CytochromeC浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：20ng/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。血清、血浆作1：10稀释（取20ul，加标本稀释液180ul,稀释10倍）。2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，**管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应CytochromeC含量即可，再乘上稀释倍数即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的CytochromeC检测浓度小于15pg/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的人CytochromeC。不与人其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]
2018-09-13 10:01
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A sandwich structured SiO2/cytochrome c/SiO2 on a bo

A sandwich structured SiO2/cytochrome c/SiO2 on a bo[详细]
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大鼠细胞色素CP450（Cytochrome C P450）ELISA试剂盒说明书

电话：021-6533363955229872网址：http://www.westang.com大鼠细胞色素CP450（CytochromeCP450）ELISA试剂盒原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠CytochromeCP450单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的CytochromeCP450与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠CytochromeCP450，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，CytochromeCP450浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中CytochromeCP450浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：20ng/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，**管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应CytochromeCP450含量即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的CytochromeCP450检测浓度小于15pg/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的大鼠CytochromeCP450。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]
2018-09-13 10:00
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人细胞色素CP450（Cytochrome C P450）ELISA试剂盒说明书

人细胞色素CP450（CytochromeCP450）ELISA试剂盒原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人CytochromeCP450单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的CytochromeCP450与单抗结合，加入生物素化的抗人CytochromeCP450，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，Z后加终止液，在450nm处测OD值，CytochromeCP450浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中CytochromeCP450浓度。试剂盒组成（2-8℃保存）酶标板（CoatedWells）96孔酶标抗体工作液（EnzymeConjugate）12ml10×标本稀释液（SampleBuffer）12ml20×浓缩洗涤液（WashBuffer）50ml标准品（Standards）：20ng/瓶2瓶底物工作液（TMBSolution）12ml**抗体工作液（BiotinylatedAntibody）12ml终止液（StopSolution）12ml准备试剂与收集血样1.收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，**管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）检测程序1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。3.每孔中加入**抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。4.洗板：同前。5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。6.洗板：同前。7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。8.每孔加入100ul终止液混匀。9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。结果计算与判断1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应CytochromeCP450含量即可。试剂盒性能1.灵敏度：Z小的CytochromeCP450检测浓度小于15pg/ml。2.特异性：可同时检测重组或天然的人CytochromeCP450。不与人其它细胞因子有交叉反应。3.重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。注意事项1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致极ng确度误差及OD值错误地升高。3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。4.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！[详细]
2018-09-13 10:01
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Electroanalytical determination of acetaminophen usi

Electroanalytical determination of acetaminophen usi[详细]
2024-09-30 18:37
实验操作
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Cytochrome Oxidase Activity

CytochromeOxidaseActivityColorimetricAssayKitrev.04/13(Catalog#K287-100;100assays;Storeat-20°C)I.Introduction:CytochromecOxidase(EC1.9.3.1)orComplexIVisthefourthcomplexoftheElectronTransportChainlocatedinthemitochondrial(orbacterial)membrane.Itprovidesenergytothecellbycoup领electrontransportthroughtheCytochromecchainwiththeprocessofoxidativephosphorylation.ComplexIVcontains13differentsubunitsencodedbybothmitochondrialDNAandnuclearDNA.ItreceivesanelectronfromeachofthefourCytochromecmolecules,andtransfersittooneoxygenmolecule,convertingitintotwomoleculesofwater.Inthisprocess,italsobindstofourprotonmoleculesandtranslocatesthemacrossthemembranetoestablishelectrochemicalgradient,whichisutilizedforthesynthesisofATP.CytochromeOxidaseActivityAssayKitissimple,fastandhigh-throughputadaptable.Thisassaykitcanbeusedforpurifiedmitochondriaortissueextractscontainingmitochondria.TheactivityoftheenzymeisdeterminedcolorimetricallybyfollowingtheoxidationofreducedCytochromecasanabsorbancedecreaseat550nm.Theoverallreactionisasfollows:II.Application:FastandsimplemeasurementofCytochromeOxidaseenzymaticactivityin96-wellplateformat.Mitochondrialrespirationstudies,assemblyofthecomplexes,Mitochondriaoutermembraneintegrity.III.SampleType:PurifiedmitochondriaCells/TissueextractsIV.KitContents:V.UserSuppliedReagentsandEquipment:Multi-wellspectrophotometercapableofreadingabsorbance.Multi-channelpipetVI.StorageandHand领:Storekitat-20°C,protectedfromlight.WarmAssayBuffertoroomtemperaturebeforeuse.KeepEnzymeDilutionBufferonice.Readtheentireprotocolbeforeperformingtheassay.VII.ReagentPreparationandStorageConditions:DTT:Aliquotandstoreat-20°C.Thawjustbeforeuse.Cytochromec:Reconstituteeachvialwith1mlofCytochromeOxidaseAssayBuffer.Mixbyvortexingtodissolvecompletely.Add5<lofDTTsolution.Mixwellandwaitfor15min.atroomtemperature.Keepthisworkingsolutionatroomtemperature.Afterassayiscompleted,aliquotandsaverestoftheCytochromecsolutionat-20°C.ThisisnowreducedformofCytochromec.VIII.ComplexIVActivityAssayProtocol:1.EfficiencyofReductionofCytochromec:Ina96-wellplate,mix20<lofreducedCytochromecwith100<lofCytochromeOxidaseAssayBuffer.PrepareaparallelwellasblankwithonlyAssayBuffer.ReadODat550nm.TheODat550nmofreducedCytochromecisbetween0.2-0.6.Ifnot,add5<lofDTT/mlofreconstitutedCytochromecandwaitfor15min.toreadagaintheOD.2.SamplePreparation:Isolatemitochondriafromculturedcells,yeastortissuesbyusingMitochondria/CytosolFractionationKit(BVcat.#K256)orYeastMitochondriaIsolationKit(K259-50)orusecellortissuelysate(BVcat.#1067).Therecommendedrangeofpurifiedmitochondriais0.5-5<gandtissueextractis1-60<gperreaction.Dilutethetestsamples,ifneededbyEnzymeDilutionBuffer.3.Cytochromecpreparation:Prepare1:6dilutionofCytochromecbyusingpre-warmedCytochromeOxidaseAssayBuffer(onepartofCytochromecto5partsofbuffer)inaseparatetubedependingonthenumberofassaysamplesandcontrols.Prepare120<lofdilutedCytochromecperreaction.4.ComplexIVActivityAssay:Beforethereaction,setthespectrophotometerat550nmonkineticprogramfor30-45minutesat30secinterval.Addthetestsamples(approx.volume5-10<l)toeachwellofa96-wellplate.Fornegativecontrol(Blank),addequalvolumeofEnzymeDilutionBuffer.Add120<lofthedilutedCytochromecfromStep3toeachsampleandcontrolusingamultichannelpipette.ShakeandimmediatelyreadandrecorddecreaseinODoveraperiodof30-45min.Note:Therateofthereactionisrelativetoacontrolornormalsample.Therateiscalculatedinlinearrange.5.Calculations:CalculaterateofthereactionbycalculatingchangeinOD:OD/minbyusingthemaximumlinearrate.Theoxidation[详细]
2018-11-08 10:00
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