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辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒说明书

本文由 上海索宝生物科技有限公司 整理汇编

2018-09-02 10:00 2519阅读次数

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辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒说明书(50T)一、测定意义:NAD是糖酵解和TCA循环的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态,NADH/NAD比值升高也可YZ糖酵解和TCA循环。另外,NAD降解产物具有非常重要的调控作用。二、测定原理:NAD和NADH在254nm下有吸收峰,利用GX液相色谱法在相应波长下测定其含量。三、试验中需自备的仪器和试剂:GX液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、针头式过滤器(水系,50个,0.22μm)、滤膜(水系和有机系各2个,0.45μm)、C18柱(4.6×150mm)、可调式移液器、样品瓶(50个,2mL)、乙腈(120mL)、甲醇(色谱级,300mL)、蒸馏水注:若用自动进样器,需要样品瓶,测定时将不少于1mL的样品或标准品加入样品瓶中。无自动进样器,需手动进样时,不需要样品瓶,用进样针将不少于20ul的样品或标准品打入进样阀。四、试剂的组成和配制:试剂一:粉剂1×1瓶,粉剂2×1瓶,4℃保存;临用前用少量蒸馏水将粉剂1和粉剂2溶解后倒入容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,形成NAD和NADH提取液(注:试剂瓶中的粉剂要冲洗干净),4℃保存3个月;试剂二:粉剂1×1瓶,粉剂2×1瓶,粉剂3×1瓶,4℃保存;临用前用少量蒸馏水将粉剂1、粉剂2和粉剂3溶解后倒入容量瓶中,用蒸馏水定容至1000mL,形成流动相缓冲液基质(注:试剂瓶中的粉剂要冲洗干净),4℃保存3个月。试剂三:NAD标准品5mg×1支,-20℃保存。加入1mL试剂一,配成5mg/mL溶液,现配现用,用不完的试剂-20℃保存。试剂四:NADH标准品5mg×1支,-20℃保存。加入1mL试剂一,配成5mg/mL溶液,现配现用,用不完的试剂-20℃保存。五、实验前的准备工作:1.将双蒸水1000mL、流动相缓冲液基质1000mL、甲醇300mL和乙腈120mL用0.45μm的滤膜抽滤,以除去溶剂中的杂质,防止堵塞色谱柱。(注:双蒸水和缓冲液基质用水系滤膜抽滤,乙腈用有机系滤膜抽滤)。2.流动相的配制:将抽滤完毕的流动相缓冲液基质1000mL与乙腈配比为9:1(v/v),即取900mL缓冲液基质与100mL乙腈混合。[每个样品需要约12mL流动相,流动相用量(mL)=12mL×样品数量+跑基线用量(约50mL),流动相的用量请根据样品数量用多少配多少]。3.将抽滤完毕的甲醇和双蒸水配比成1**%的甲醇,10%的甲醇,双蒸水各250mL。4.将2和3中的溶剂超声30分钟,以脱去溶剂中的气泡,防止堵塞色谱柱。六、辅酶ⅠNAD(H)的提取:组织的处理:准确称取组织重量,按重量体积比(g/mL)加9倍试剂一,提取NAD和NADH,制成10%匀浆。20000g/min离心30min,取上清液用0.22μm水系针头式过滤器过滤后待测,同时测定组织蛋白含量。细胞处理:收集于60mL细胞,离心菌体经高压冷冻干燥12h后,加入2mL试剂一。超声破壁细胞(950W,30%,15min,工作1s,间隔2s),再经10,000r4℃高速离心40s,上清用0.22μm水系微孔滤膜过滤后直接上柱检测。七、辅酶ⅠNAD(H)含量测定操作步骤:1.开启电脑、检测器和泵,安装上色谱柱,打开empower软件,在方法组中设置进样量20μL,流速0.8mL/min,保留时间15min,检测波长254nm,设置完毕保存方法组。2.用1**%的甲醇、10%的甲醇、双蒸水按甲醇浓度从大到小的顺序洗色谱柱30min。3.用流动相洗柱子,待基线稳定后开始加样。4.加入标准品20μL,在15min内可分离NAD和NADH,NAD的保留时间在3min左右,NADH的保留时间在7min左右(柱子不同,保留时间有差异),计算不同浓度的NAD和NADH标准品的峰面积。5.加入样品20μL,在相应保留时间处检测NAD和NADH的峰面积。八、辅酶ⅠNAD(H)含量的计算:1.NAD含量的计算NAD标准曲线的绘制:将5mg/ml的NAD标准品用双蒸水分别稀释成110μg/ml、80μg/ml、50μg/ml、和20μg/ml的NAD标准品溶液,计算不同标准品溶液的峰面积。计算标准曲线公式为:y=25069χ-26754(χ为NAD浓度,μg/ml;y为峰面积)推出:χ=(y+26754)÷25069(χ为NAD浓度,μg/ml;y为峰面积)NAD含量(μg/mgprot)=(样品峰面积+26754)÷25069÷CprotCprot为待测样本蛋白浓度2.NADH含量的计算NADH标准曲线的绘制:将5mg/ml的NADH标准品用双蒸水分别稀释成200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml和50μg/ml的NADH标准品溶液,计算不同标准品溶液的峰面积。计算标准曲线公式为:y=13275χ+35717(χ为NADH浓度,μg/ml;y为峰面积)推出:χ=(y35717)÷13275(χ为NADH浓度,μg/ml;y为峰面积)NADH含量(μg/mgprot)=(样品峰面积-35717)÷13275÷CprotCprot为待测样本蛋白浓度注:标准品的稀释倍数要根据样品中NAD和NADH浓度确定,样品中NAD和NADH的峰面积必须落在不同浓度的NAD和NADH标准品的峰面积之内,该标准曲线紧供参考。ShanghaisolarbioBioscience&TechnologyCo.,LTD上海索莱宝生物科技有限公司是一家集销售生化试剂、实验耗材、自产分子生物学产品为一体,并能提供技术支持的专业性生物科技公司。公司秉承“以客户为ZX,以产品为保障、以诚信为基础、以创新为宗旨”的发展理念,在依靠客户的大力支持和员工的不懈努力下获得了快速的成长。公司组织结构清晰,内部管理科学,拥有一支既分工细致又高度合作的年轻化队伍,保持了各个部门之间的GX合作运转,充分保障了公司在充满竞争的市场中处于领xian地位。公司注重与业界精英合作,目前公司已经和Amersham、Amresco、Axygen、BD、Corning、Dragon、Eppendorf、企业结成紧密的合作伙伴关系,代理其领xian世界的产品,并在全国各地设有分销机构。我们将以高度的责任感和出色的产品质量为客户提供高品质的产品和实验技术解决方案。丰富的经验、优良的品质、充足的库存、准确的交货时间、极具竞争力的价格,所有这些都保证了我们向您提供的是Z专业Zyou质的服务!立足北京,上海,辐射全国,随着产品营销战略的不断延伸,我们将逐步发展成为yi流的专业性生物科技公司。我们希望能够和尊敬的客户一起,利用各自的资源优势和勇于进取的敬业精神,为ZG生命科学研究的发展作出更多的贡献。为了更好、更全面的发展,现公司正在诚招各地dai理商和招聘若干销售、研发人员,欢迎垂询并期待您的加入!辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒上海索宝特价【021-54100800】联系方式上海索莱宝生物科技有限公司电话:021-6485566518018609966传真:021-54261506邮编:200233地址:上海市钦江路15号14层邮箱:solarbio@126.com网址:www.shsolarbio.com优质试剂质量放心价格Zdi为ZG生物产业做贡献

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