超高效液相色谱仪使用步骤

超高效液相色谱仪（UHPLC）标准操作规程与核心要点分享

在当今的分析实验室中，超高效液相色谱（UHPLC）凭借其的分离效能、极高的分析速度以及更低的溶剂消耗，已成为药物分析、环境监测及食品安全检测等领域的核心工具。相比传统HPLC，UHPLC利用微小粒径（通常小于2μm）的填料，在极高压（可达15,000 psi以上）下运行，这对操作者的规范性提出了更高要求。本文结合一线实战经验，系统梳理了UHPLC的标准操作步骤及关键技术参数。

实验前准备：流动相与色谱柱的预处理

UHPLC系统极其精密，微小的颗粒物都可能导致进样阀堵塞或色谱柱压力飙升。

1. 流动相过滤与脱气：所有水相和有机相必须通过0.22μm的滤膜过滤。虽然许多设备带有在线脱气机，但对于关键项目，预先超声脱气5-10分钟仍是确保基线稳定的好习惯。
2. 色谱柱检查：确认色谱柱的使用历史。检查填料类型、孔径及耐受压力范围。在安装前，务必检查PEEK管路或不锈钢管路的接头是否匹配，避免产生死体积导致峰展宽。

系统启动与平衡：建立稳定的压力环境

启动系统后，不要急于进样，必须确保系统整体状态达到平衡。

1. 排气（Purge）：开启排气阀，以较大流速（如3-5 mL/min）冲洗泵体，排除管路中的气泡。
2. 低流速过渡：关闭排气阀，从0.1 mL/min开始缓慢提升流速，观察柱压变化。UHPLC的压力升高非常迅速，严禁直接开启高流速冲击色谱柱。
3. 基线与压力波动监控：观察色谱柱压力脉动（Pressure Ripple）。通常情况下，压力波动应小于总压力的1%。待基线平稳、压力波动恒定后，方可进行下一步。

样品处理与进样：防范污染与过载

UHPLC的进样量通常在0.5-5μL之间，极小的系统体积意味着样品必须高度洁净。

1. 样品过滤：样液必须经过0.22μm针式过滤器或高速离心（12,000 rpm以上）。
2. 溶剂效应关注：尽量使用初始比例的流动相作为样品溶剂。如果样品溶剂强度显著高于初始流动相，在UHPLC的高效分离下，极易出现峰形畸变或分叉。

过程监控：核心技术参数参考表

在运行过程中，建议实时监控以下关键指标，以判断系统运行是否处于优状态：

停机维护：延长系统寿命的“黄金法则”

实验结束后的处理直接决定了仪器的使用寿命。

1. 系统冲洗：如果使用了缓冲盐（如磷酸盐、乙酸铵），必须先用高比例水相（如95%水+5%甲醇）冲洗至少30分钟，彻底置换系统内的盐分，防止盐析造成泵密封圈磨损。
2. 溶剂保全：长期停机时，应将管路切换至纯有机溶剂（如纯甲醇或乙腈）密封保存，防止微生物滋生。
3. 记录与复盘：详细记录色谱柱的柱压、理论塔板数以及保留时间的变化。如果发现压力较初始状态升高了20%以上，应考虑更换保护柱芯或进行色谱柱再生。

结语

UHPLC不仅仅是压力的提升，更是对分离科学精度的极致追求。作为从业者，我们需要在操作中时刻保持“精细化”理念，从流动相的纯度到接头的连接深度，每一个细节都会在终的谱图中得到反馈。通过规范化的操作流程，不仅能获得高质量的科研数据，更能大程度保护昂贵的仪器资产。