超高效液相色谱仪校准规程

超高效液相色谱仪（UHPLC）校准规程与实操要点

在实验室精密分析领域，超高效液相色谱仪（UHPLC）凭借其高压泵系统、极小的死体积和超高灵敏度，已成为药物研发、环境监测及食品安全检测的核心工具。由于UHPLC通常在极高压力（可达15000 psi以上）和微小流量下运行，其性能状态对分析结果的准确性影响极大。定期进行规范化校准，不仅是满足CNAS/CMA资质认定的要求，更是确保实验数据可靠性的技术基石。

校准环境与基准物质准备

开展校准前，实验室环境必须保持稳定。温度应控制在15℃-30℃之间，波动每小时不超过2℃，避免阳光直射和强电磁干扰。校准所需的溶剂须达到色谱级或超纯水级别，并经过0.22μm微孔滤膜过滤及超声脱气。

核心基准物质通常选用国家有证标准物质（CRM），如甲醇中萘标准溶液。对于波长准确度的校准，常采用氧化钬滤光片或特定吸收峰明显的标准溶液。

核心技术指标校准规程

1. 输液泵流量设定值误差与稳定性

流量的准确性直接决定了组分的保留时间。校准时，在UHPLC常用流量（如0.2mL/min或0.3mL/min）下，利用万分之一电子天平及容量瓶，采用称重法测量一定时间内泵出的液体质量。

• 流量设定值误差（Ss）：反映泵输出的准确度。
• 流量稳定性误差（Sr）：反映泵运行的平稳程度，UHPLC要求通常比常规HPLC更为苛刻。

2. 柱温箱温度示值误差

UHPLC色谱柱由于粒径小，对温度极其敏感。校准时将高精度数字温度计的探头置于柱温箱内靠近色谱柱的位置，分别设定30℃、50℃等典型工作温度。待稳定后，记录示值误差。

3. 检测器性能：噪声、漂移与定量重复性

以紫外-可见光检测器（UVD）为例，在不接色谱柱的情况下，以甲醇为流动相，观察基线。

• 基线噪声与漂移：反映检测器电路稳定性及光源寿命。
• 定性及定量重复性：通过连续6次注入标准品溶液，计算保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD），这是衡量系统综合性能的核心指标。

UHPLC校准技术指标参考表

以下数据基于行业主流标准及高精度实验要求整理，可作为实验室内部评审参考：

梯度洗脱准确性：UHPLC的“隐形”

不同于常规HPLC，UHPLC常涉及复杂的梯度比例。梯度准确性校准通常采用示踪剂法（如在B瓶中加入0.1%的丙酮，A瓶为纯水）。通过设置0%、10%、50%、90%、100%等阶梯比例，观察紫外吸收曲线的阶梯线性。若阶梯出现明显圆弧或延迟，通常提示比例阀故障、泵头气泡或混合器效率下降。

从业者建议：维护与校准的协同

在实际操作中，不能“为了校准而校准”。 ，系统清洗。校准前应用热的超纯水彻底清洗系统，去除可能残留的缓冲盐。 第二，压力波动监测。UHPLC的压力脉动应控制在1%以内，若脉动过大，即便流量准确，保留时间也会出现漂移。 第三，进样器清洗频率。UHPLC进样器死体积小，交叉污染（Carry-over）风险大，校准重复性时需额外关注洗针液的效能。

通过严谨的校准流程，不仅能延长昂贵的亚二微米色谱柱的使用寿命，更能确保在面临复杂基质样品时，实验数据具有无可争议的说服力。