超高效液相色谱仪使用注意事项

超高效液相色谱（UHPLC）操作核心规范与维保要点

在实验室分析领域，超高效液相色谱（UHPLC）凭借其高分离度、高灵敏度和极快的分析速度，已成为精密分析的标配。由于其系统压力常年处于 10000 psi 以上，且管路内径极细，这对操作者的规范性提出了极高要求。以下结合一线应用经验，总结出 UHPLC 使用中必须严格遵守的注意事项。

流动相的极效过滤与脱气

UHPLC 系统精密度极高，任何微小的颗粒物或气泡都会对泵头和进样阀造成不可逆的磨损。

1. 溶剂等级选择： 必须使用色谱级或质谱级溶剂。普通分析纯试剂中的不溶性微粒在超高压下会迅速堵塞 0.2μm 的在线过滤器。
2. 强制过滤： 即使是购买的色谱级溶剂，在配制缓冲盐后，必须使用 0.22μm 的微孔滤膜进行二次过滤。
3. 彻底脱气： UHPLC 对气泡极其敏感。除在线脱气机外，建议流动相在使用前进行超声脱气 15-20 分钟，以防止在高压下产生细小气泡导致的压力波动（Pressure Ripple）。

样品前处理的“洁癖”原则

由于 UHPLC 色谱柱填充剂粒径通常小于 2μm，样品中的杂质是造成柱压升高的主要原因。

• 样品过滤： 进样前样品必须经过 0.22μm 针式过滤器过滤。
• 溶剂效应预防： 样品的溶解溶剂应尽可能与初始流动相比例一致。若进样溶剂洗脱强度过高，会导致峰形展宽或峰分裂。
• 离心处理： 对于复杂基质（如生物样本、食品提取液），建议在过滤前以 12000 rpm 的转速离心 10 分钟。

UHPLC 与传统 HPLC 关键参数对比

为了更直观地理解 UHPLC 的操作边界，下表列出了其与传统 HPLC 的性能差异：

色谱柱的“温和”启停

超高压环境下的物理冲击是损坏色谱柱的头号杀手。

1. 压力平衡： 开机后，流速应采取分段梯级上升（如 0.1 -> 0.2 -> 0.4 mL/min），给予填料床层适应压力的缓冲时间，严禁直接开启大流速。
2. 温度补偿： UHPLC 色谱柱通常在较高温度（40-60℃）下运行以降低流动相粘度。必须等待柱温箱达到设定值后方可进样，否则波动的粘度会导致保留时间漂移。
3. 冲洗程序： 实验结束后，若使用了缓冲盐，必须先用过渡比例的有机相/水（如 10:90）冲洗系统，再切换至纯有机相封存，严禁直接切换至高比例有机相导致盐析出。

系统连接的零死体积要求

在 UHPLC 系统中，死体积（Dead Volume）的微量增加都会直接摧毁其高分离度的优势。

• 管路切割： 使用专用切管器，确保截面水平、无毛刺。
• 接头匹配： 强烈建议使用厂家原装的 PEEK 或不锈钢高压接头。手动拧紧后再用扳手补强（通常为 1/4 圈），确保接头顶端紧贴进样阀底部。

日常监测与预防性维护

从业者通常会建立系统“指纹图谱”。每日记录空载压力、背景噪音水平以及标准品的对称因子。一旦发现背压较初始状态升高 15% 以上，应立即检查在线过滤器及保护柱。定期更换泵密封圈和单向阀芯，是保障实验室长期稳定产出数据的基石。