流式细胞仪实验操作中样本的质量控制

流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代Z先进的细胞定量分析技术之一。

有非常多种类的样本被用于流式分析，像皮肤、骨sui穿刺液、组织活检物、浆膜腔积液、外周血、脑脊液、骨sui活检物、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等。免疫表型分析质控Z困难的步骤之一可能就是是样本的条件控制。不同的样本在采集、保存、运输和制备方面都有不同的要求。所以Zxian需要观测样本的外观：如果有严重溶血、凝聚或坏死的样本应该果断弃用。

单细胞悬液的获取：

外周血和骨sui穿刺液是天然的单细胞悬液；活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。不同的实验需要选择不同的方法。对于需要进行膜抗原标记的，不仅要获得足够多的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性，选择机械法比较好。只需进行细胞周期或DNA倍体分析的，在机械法的基础上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）比较好。

抗凝剂的选择：

外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果采用同一份血液标本做白细胞计数和流式分析，需要用EDTA抗凝；对于血小板分析的实验，通常不需要用肝素抗凝。骨sui穿刺液一般使用肝素或EDTA抗凝。因为相对大量的ACD会改变pH，从而可能影响骨sui细胞活性，所以一般不推荐使用ACD作骨sui穿刺液的抗凝剂。

样本的保存：

理想状态下，样本需要在采集后立即进行处理和染色。肝素抗凝的血和骨sui在室温条件下一般可以保存至48-72小时；EDTA抗凝的外周血和骨sui在室温条件下一般可以保存12-24小时；ACD抗凝的外周血在室温条件下一般可以保存至72小时；对于只作胞内染色的样本，可以固定细胞以便长期保存。然而“固定－染色”的方法是由要分析的抗原特性和染色方式决定的。

去除红细胞的方法：

红细胞裂解法，操作简单、速度快、并Z可能保持原始标本的白细胞分布。Z好在染色后溶血。如果要在染色前溶血，要保证：

（1）溶血过程中抗原性不能被改变；

（2）溶血剂彻底被洗去，细胞和抗体结合的动力反应没有受到影响；

（3）所用的溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。密度梯度离心法，靶细胞回收较好并可能得到富集，同时去除红细胞、碎片等。

细胞与抗体的比例：

厂家推荐的抗体用量一般是假设靶细胞数量在5*10的五次方-1*10的六次方之间。一些标本没有足够的细胞，一些标本的细胞量过大，正常浓度下的抗体相对过量或不足，可能会造成假阳性或假阴性结果。所以，每个实验室需要根据于厂家推荐的方法不同的方法，调整细胞与抗体用量，得到Z合适的细胞/抗体比例。

细胞活性的鉴定：

死细胞对许多抗体都有很强的非特异性染色，所以样本细胞活性检测尤为重要，特别是经过长时间运输和储存的样本。一般有三种检测的方法：

（1）实时的流式检测：

利用PI、7-AAD或EMA进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。这个方法的优势是细胞表面标志和活性分析能够同时进行。对于高度坏死的样本特别适用。7-AADZ常用，因为在488nm激发下，其Zda发射光在670nm左右，适合与FITC或PE进行多色标记。然而随着时间延长，7-AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。所以，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，Z好用EMA。EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。

（2）手工检测：

使用Trypanblue或其他细胞活性染料。

（3）使用专门的仪器进行检测。