HPLC分析和纯化

使用柱子和泵系统来对HPLC进行分析，能够对高压经受传递，如此填料能够采用极细的微粒（3-10μm），所以需要在几分钟以内对多肽进行高度的分析。

HPLC分类

HPLC包括离子交换和反相两类。

和正常层析相比，反相HPLC条件恰恰相反。通过疏水作用，多肽在柱上连接，洗脱采用将离子强度降低的方式，例如将洗脱剂的疏水性增加。一般由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成柱子这种链为G4-G8碳原子那么长。因为洗脱是一种疏水作用，所以用短链柱对大的疏水肽进行洗脱比较好。但是，在具体的实验中，这两类柱互变的区别不是非常的显著。由碳水化合物构成如苯基的别类载体。

离子交换HPLC是以多肽和固相间的直接电荷相互作用为依靠。在一定PH范围，一种离子体由柱子带有的特定电荷衍变而成，但是相反电荷由多肽或多肽混合物的氨基酸组成表现出来。一种电荷相互作用叫做分离，洗脱出多肽方法为改变离子强度或者PH或者将两者均改变。一般，低离子强度的溶液首先使用，再将离子强度一步一步加强，直到从柱中洗脱出多肽。使用强阳离子交换柱为离子交换分离的一个例子。

一般80%acetonitrile0.1%TFA--H2o稀acetonitrile和0.1%TFA-H2O这两种缓冲剂组成典型的操作。以每分钟0.5%到1.0%改变的速度用线型梯变进行混合。如果用径向填柱，那么大小是25×250mm(10μm)和(10μm).8×100（3-10μm），如果为常见分析和纯化用柱，那么大小为4.6×250mm(3-10μm)和22×250mm。

有许多不同的试剂包含在各种缓冲剂中，值得一提的是在高pH或者微碱pH下能长时间暴露硅反相柱料，否则会对柱子产生破坏。