流式细胞仪的技术发展

　　流式细胞仪与其他细胞分析仪器相比，具有突出的技术特征，这些技术特征的不断改进就大致地代表了流式细胞仪的技术发展过程。

　　1、高速度:

　　分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。流式细胞仪是以高速度的数据处理电子系统信号，配合GX的液流控制系统，有力地保证了流式细胞仪的检测功能。

　　流式细胞仪对细胞的检测速度一般为1000~5000个/s;而到目前为止，对细胞的标准分析速度已达到了2×10⁴个/s，Zda分析速度可达到6×10⁴个/s。

　　2、高灵敏度:

　　灵敏度的高低是衡量流式细胞仪检测微弱荧光信号的重要指标，一般是以能检测到单个微球上Z少标记有异硫氢酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)荧光分子数目来表示。

　　以前，每个细胞要带有1000~3000个FITC分子才能在流式细胞仪上测量出来;目前，一个细胞上只要带600个荧光分子，甚至带100个FITC分子，即可以被检测和分选出来。

　　3、高准确度:

　　以前，在两个细胞间待测细胞成分存在5%以上的差异时，流式细胞仪才能检测出来;目前，两个待测细胞间细胞成分仅相差1%左右时，流式细胞仪便可检测出来。例如，在检测男人和女人外周血淋巴细胞DNA含量时，仅仅是X染色体和Y染色体DNA含量之间有所区别(大约相差约占整个细胞的2%左右)，应用流式细胞仪便可以轻而易举地把男人和女人的淋巴细胞区分开并分选出来。

　　4、高精度:

　　分辨率是衡量流式细胞仪测量精确度的指标，通常用变异系数(CV)值来表示。用流式细胞仪检测某种细胞成分时，比用其他分析细胞学技术的CV值都要小得多，分辨率要高得多。众所周知，用某种仪器分析细胞时，其CV值越大，分析结果越不精确。

　　以前的流式细胞仪，在分析细胞样品时，CV值只能达到5%~7%左右，前向角散射光分辨率仅为0.3μm。流式细胞仪前向角散射光的分辨率已达到0.02μm。流式细胞仪的电信号脉冲通道，从当初的128道→256道→1024道，直到目前一般已达到40%道，有的甚至还可以达到5120道。

　　信号脉冲通道数分布越多，对细胞的分辨率就越高，对细胞的分析就越精确。例如，目前，各流式细胞仪生产厂家生产的流式细胞仪，都能以高精确度来分析人类染色体的畸变，通过二维图显示扩展群体分布，极大地提高了流式细胞仪的分辨率。另外，通过对脉冲系统功能的改进，也提高了细胞参数分析的质量。

　　5、多参数:

　　流式细胞仪分析细胞时，可以从一个细胞中同时获得多种细胞信息。由于流式细胞仪采用的光源不断改进从开始的单一的激光器或紫外光器，至目前发展为采用2-3个激光器，或再加一个紫外光器。

　　有的采用立体空间激光系统，实现多荧光道分析，Zda程度地减少荧光信号之间的补偿，提高检测的灵敏度，所以，利用空间立体激发的多激光系统可以提高多参数的分析质量。

　　目前的单激光四色分析或双激光四色分析的流式细胞仪，488nm激光器激发出的4种不同荧光光谱之间常有重叠，做4色分析时，难以避免荧光过多重叠而导致的补偿困难。利用该系统对488nm激光产生的3色荧光与635nm激发而产生的第4种荧光分成两种信号，能Zda程度地减少补偿，使4色荧光达到Zwan美的效果。

　　因此在一个细胞中，除分析前向角和侧向角的散射光参数外，还可以检测到3种、4种、6种，甚至到8种荧光参数，这显著增加了流式细胞仪的信息量，提高了工作效率和科学性。

　　6、高纯度:

　　流式细胞仪的重要功能之一是能分选出实验者所需要的任何细胞。其分选指标主要包括:分选速度、分选纯度和细胞回收率。这些指标均随流式细胞仪的技术发展而逐渐得到改善和提高。

　　目前流式细胞仪分选细胞速度已达到6×10⁴~1×10⁵个/s，分选纯度为99.9%以上，分选回收率也达90%以上。

　　7、其他几方面的技术改进:

　　①荧光信号从线性测量到对数测量的改进，由于对数测量可以放大电信号，使之对弱荧光和某些药物自发荧光标本检测才得到满意的结果;

　　②光谱重叠的校正，通过补偿修饰软件的开发应用，从而保证了各种不同激发荧光检测分析的质量;

　　③DNA含量分析时，通过分析脉冲的面积、宽度，区分实体瘤组织标本中的粘连细胞群体，剔除DNA检测中的二联体细胞，Zda程度地减少假阳性，从而解决了实体瘤DNA分析时长期存在的关键性的难题;

　　④过去采用激光的一种波长(如488nm)的发射光仅能激发样品中一种波长的继发光，因此，只能检测细胞中一种细胞成分。现在流式细胞仪采用一种488nm激发波长的发射光，可以同时激发样品中三种或四种不同波长的继发光，这便可用于同一细胞不同成分的同步分析。