紫外分析仪RAPD操作规程

紫外分析仪分为很多系列，有三用紫外分析仪、暗箱式紫外分析仪、可照相紫外分析仪等系列，不同的紫外分析仪有不同的用途。紫外分析仪采用不同波长引进电泳分析、检测，PCR产物检测，DNA指纹图谱分析，纸层分析或薄层分析等。

操作规程

1.制备DNA

对萨姆布鲁克等（1996) 的方法加以参照并且稍稍改进。

（1）在裂解液中溶入切碎的100 mg左右的足肌。

（2）将蛋白酶K加入使终浓度为100μg/ ml，充分混合均匀之后在37摄氏度下消化4～5小时。

（3）依次将体积的饱和酚、酚/ 氯仿/ 异戊醇（25 ：24 ：1) 和氯仿/ 异戊醇（24 ：1) 抽提蛋白加入到样品中，之后使用双倍体积的无水乙醇沉淀，干燥DNA以后再将适量TE加入溶解，保存在4摄氏度下。

（4）使用紫外分光光度计对DNA 纯度进行测定和对模板浓度进行估算，并且采用琼脂糖凝胶电泳对DNA分子量进行检测。

2、扩增

试剂：

20 ng 模板DNA

2U Taq 酶

0.12 mmol/ L dNTPs

0.12 mmol/ L 引物

2 mmol/ L Mg2+

10 ×Buffer

反应总体积为25μl。

仪器：

PCR 扩增仪

PCR反应程序：

（1）95摄氏度下预变性5分钟，94摄氏度下变性45秒，36摄氏度下复性45秒，72摄氏度下延伸90秒，经过30个循环，72摄氏度延伸10分钟，保存于4摄氏度。

（2）每次不含模板DNA 的空白对照都设于PCR 反应中。

（3）通过1.2 %琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录。

3、处理数据

记RAPD 电泳谱带位点上无扩增位点为0，有扩增位点的为1，将原始数据矩阵建立，统计数据利用Pop Gene（Ver1132) 软件。