用Klenow片段合成单链探针的操作方法

分子杂交（molecular hybridization）是指使单链核酸碱基序列确定的技术。待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对使可检出的双螺旋片段形成为分子杂交的基本原理。下面就让小编带你了解一下用Klenow片段合成单链探针的操作方法。

概念

可以在噬粒或M13噬菌体载体中通过从M13载体衍生序列合成的单链DNA探针克隆模板序列，放射标记探针可以在[a-32P]-dNTP的存在下，引物为特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸以及以上述为模板通过lenow片段作用合成，一部分双链分子在完成反应后得到。这些长短不一的产物可以在克隆序列内或下游用限制性使用内切酶进行切割，再使用变性凝胶电泳分离开模板和探针。

操作准备：

试剂：0.5mol/L EDTA （pH8.0）；适宜的限制；Klenow片段；dCTP,dTTP,dGTP溶液；未标记的dNTP溶液；[α-32 P] dATP；0.1mol/L DTT溶液；10×Klenow缓冲液。

设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

材料：已制备好的单链DNA模板。

操作步骤：

在0.5ml eppendorf管中将3ml 10×Klenow缓冲液，5pmol适当引物以及1mg单链模板加水混合成20ml溶液。加热eppendorf管到85℃5min，在半个小时之内，降低小离心管的温度到37℃。将2ml，5ml[a-32P]dATP，1ml未标记dATP以及1mldGTP,dCTP,dTTP混合液混匀之后，稍微离心从而使其在试管底部沉淀。将1ml（5单位）Klenow酶加入在室温下30min，将1ml20mmol/L未标记的dATP溶液加入在室温下30min，将溶液加热到68℃10min，从而使得Klenow片段失活，为了适合酶切，对NaCl的浓度进行调整。将20单位限制性内切酶加入，酶切1h.使用酚/氯仿抽提DNA，加入乙醇沉淀从而将dNTP去除或者将0.5mol/L EDTA(pH8.0)加入知道，溶液的浓度为10mmol/L为止。放射性标记的探针使用电泳方法分离。