琼脂糖凝胶电泳的操作流程

以琼脂或琼脂糖作为支持介质的一种电泳方法，称为琼脂糖凝胶电泳。通常采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳分离如大分子核酸、病毒等分子量较大的样品。

操作流程

准备干净的配胶板和电泳槽

值得注意的是，如果使用了DNA酶污染的仪器，可能会使得DNA降解，导致条带信号弱、模糊甚至缺失。对于巨大DNA链，普通电泳不适合，应该使用脉冲凝胶电泳。

选择合适的电泳方法

琼脂糖凝胶电泳能够对一般的核酸进行检测。若对于电泳的分辨率要求非常的高，尤其是差别仅有几个bp，应该选用聚丙烯酰胺凝胶电泳。若巨大的DNA链使用普通电泳，则有可能造成缺带。

选择合适的凝胶浓度

琼脂糖凝胶电泳浓度一般在0.5～2%之间，小片段核酸使用高浓度的进行分析，大片段核酸使用低浓度的进行分析。低浓度胶易碎，比较好的解决办法是琼脂糖选择质量好的和操作小心。值得注意的是高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失。

选择合适的缓冲液

TAE和TBE为常用的缓冲液，和TAE相比较，TBE缓冲能力更加的好。电泳时使用新制的缓冲液能够使电泳效果得到明显的提高。注意电泳缓冲液多次使用后，使得离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

选择合适的电压和温度

电泳时电泳温度应该低于30℃，电泳时电场强度应该不高于20V/cm，如果是巨大的DNA电泳，那么温度应该低于15℃。若电泳时有过高的电压和温度，那么可能造成条带模糊和不规则的DNA带迁移现象的发生。尤其是太大的电压可能造成致小片段跑出胶而出现缺带。

准备合适的DNA样品的纯度和状态

导致产生条带模糊和条带缺失的现象的发生可能是由于样品中含盐量太高和含杂质蛋白，乙醇沉淀能够将多余的盐去除，蛋白能够用酚去除。变性的DNA样品可能造成条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以预防DNA变性。

正确的DNA的上样

正确的DNA上样量能够确保条带清晰，DNA上样量过多可能造成DNA带型模糊，DNA上样量过少可能造成带信号弱甚至缺失。

选择合适的Marker

DNA电泳估计DNA片段大小一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样才能对目标片段大小作比较准确的估计。Marker的电泳同样也要与DNA电泳的操作标准相符合。

凝胶的染色和观察

溴化乙锭（EB）是实验室常用的核酸染色剂，其具有很好的染色效果，非常方便的操作，然而却没有很好的稳定性并且具有毒性。观察凝胶时应该以染料的不同为依据对合适的光源和激发波长进行使用。若激发波长不对，那么条带就不容易观察，会出现条带模糊的现象。