PCR的设想与实现、步骤以及反应物质

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设想与实现

设想

PCR从设想到研究已经有超过100年的历史了，在二十世纪60年代末、70年代初，人们对基因的体外分离技术投入了很多的精力，在1971年，核酸体外扩增的设想首先由Korana提出。

实现

1985年具有划时代意义的聚合酶链反应由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明。它的原理和DNA的体内复制类似。

步骤

标准的PCR过程包括三个步骤：

DNA变性

（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

退火

（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性Z佳）的作用下，合成与模板互补的DNA链。每经过变性、退火和延伸一循环，DNA含量就会增加一倍。

PCR反应的物质

镁离子、三磷酸脱氧核苷酸、耐热DNA聚合酶、引物以及模版均是参加PCR反应的物质，其中引物的Z佳设计是其关键步骤。

1. Mg2+浓度

镁离子可以和dNTP结合，镁离子能够很大程度上影响PCR扩增的特异性和产量。在通常的PCR反应中，当各种dNTP浓度为20μmol/L时，镁离子的浓度Z好为1.5~2.0mmol/L。如果镁离子浓度过高，那么就会降低反应特异性，使得非特异扩增出现。如果浓度过低，会使得taqDNA聚合酶的活性降低，减少反应产物。

2. dNTP

三磷酸脱氧核苷酸的质量与浓度和PCR扩增效率密切相关。在PCR反应中，三磷酸脱氧核苷酸应为50-200μmol/L，特别需要留心的是4种三磷酸脱氧核苷酸要有一样(等摩尔配制)的浓度，如果浓度过低，则会使得PCR产物的产量降低

3. TaqDNA聚合酶

2496个碱基为TaqDNA聚合酶基因的全长，当温度达到75~80℃时，每秒钟大约有150个核苷酸由一个酶分子延伸。在PCR循环的高温条件下DNA聚合酶活性和稳定性依然表现的良好。如今，可以提供两种TaqDNA聚合酶，diyi种是大肠菌合成的基因工程酶，第二种则是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶。

4. 引物

引物与模板DNA互补的程度决定了PCR产物的特异性。在理论上，只要对任意一段模板DNA序列有所了解，就可以根据其将互补的寡核苷酸链作引物设计出来。每条引物链的浓度为0.1~1μmol或10-100pmol，Z好是反应所需要的Zdi引物量的浓度。

5. 模板核酸

PCR成败与否的关键环节之一。就是模板(靶基因或样品DNA)核酸的量与纯化程度。临床检测标本通常使用快速简便的方法对细胞进行溶解，对病原体进行裂解，将染色体的蛋白质消化去除从而使靶基因游离，对于PCR扩增可以直接 使用。通常采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法对DNA模板提取，值得注意的是要防止RNA被核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)降解了。