荧光显微镜原理

　　荧光显微镜是利用特定波长的光，照射被检物体产生荧光进行镜检的光学观测仪器，已有100多年历史。荧光显微镜是在复式显微镜上安装荧光装置集合而成，荧光装置包括荧光光源、激发光光路、激发/发射滤光片组件等器件。

荧光显微镜工作原理

　　荧光显微镜是医院科研、病理、检验等部门常用的医用光学仪器之一。因为普通的显微镜是在明亮的背景上观察暗物，而荧光显微镜是在暗背景下观察彩色的图像，因此它比普通的显微镜分辨力提高100倍，可以观察到普通显微镜看不到的细节。但是它的调整，校正难度较高，只要解决了荧光显微镜的问题，其它显微镜问题就迎刃而解。

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　　下图是荧光显微镜的光学系统图。由汞灯发出的各种谱线的光线，经激发滤光片后只让某一种波长的紫外光线通过，如波长为404.7nm蓝紫光，经反光镜后，激发样品产生荧光。激发滤光片将其他波长的光线滤掉，并使样品激发荧光，所以称其为激发滤光片。通常，激发产生的荧光波长比激发样品的光的波长大得多，是可见光。这样产生的荧光和透过样品的一部分激发光(紫外光)，经物镜成像后，人眼即可用目镜观察荧光图像。为了防止紫外光进入目镜视场，降低图像衬度和损伤人眼，放置了一块截止滤光片，它只让某一部分波长的谱线通过，如只让500～750nm的可见光通过，而不让500nm以下的光通过。

　　从图中可以看出，光源是荧光显微镜主要组成部分，荧光显微镜都采用200W的超高压汞灯作光源。它是由石英玻璃制作，中间呈球形，内充有一定量的汞，工作时在两极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子在不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫光，足以激发各类荧光物质，因此被荧光显微镜普遍采用。

荧光显微镜的激发荧光方式

　　荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光源、滤片系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。

　　荧光显微镜激发荧光的方式：按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。

　　UV激发法是用短于400nm外光进行激发。该法不存在可见的激发光，所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光，容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。

　　BV激发法是以404nm、434nm为ZX的由紫外至蓝光进行激发。该方法使用蓝光照射标本，所以荧光显微镜的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。用于荧光抗体法的荧光色素。对于激发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长比较接近，所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光，所以荧光色素的吸收效率较高，可得到较明亮的图像。其缺点是500nm以下的荧光无法看到，而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中，大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性，所以在讨论微妙的特异性时，上述BV激发法的缺点往往影响极大。

　　综上所述，荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造和激发光的波长按以下三点考虑。

　　①从荧光像的反差要求来看，UV激发暗场聚光器照明Z好。

　　②以像的亮度来考虑，BV激发滤光片暗场观察效率Zgao。

　　③UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光器照明的特性，可看作介于这两种照明方法之间，但前者滤光片暗场的性质较强，显示图像较明亮，反差小;后者因保留暗场光路的性质，故显示图像较暗，而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜时，应采用Z适合标本要求的照明法进行观察。

　　必须指出，即使像反差Z佳的UV激发暗场聚光器照明，由标本折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜，这样在光学系统中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激发引起的自身荧光会使像的反应变坏。因此，必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片作为截止滤光片。