油浸流式显微镜（OI-FIM）及AI机器深度学习在生物制剂中应用的最新进展

生物制药制剂中的颗粒仍然是药物产品开发中的一个热点。 随着新产品类别的出现，区分微粒药物活性成分和微粒杂质变得至关重要的。 随着技术进步、新的分析发展和新兴工具(如机器学习工具)的推出，能够获得的颗粒信息大大增加。 为了对生成的数据进行适当的解释和判断，需要彻底理解测量原理、合适的应用以及潜在的局限性。 

生物制药，如治 疗蛋白，疫苗，以及基因和细胞治 疗产品，仍然是制药行业不断增长的领域，目前有许多批准的治 疗方法和正在进行的临床试验。 药物开发的一个关键方面是颗粒分析。 为了建立对生物制药有意义的颗粒分析方法，定义什么是“颗粒”具有很高的相关性。 根据生物制药产品的背景和/或分析范围提供定义。 对于基于蛋白质的治 疗，大于0.1毫米的聚集体被定义为颗粒，而对于颗粒输送系统，输送载体、细胞或病毒本身也是颗粒。 

一般来说，药品中的颗粒必须与其他关键质量属性(CQAs)一起密切监测，因为它们可能危及产品的质量和安全。 在蛋白质药物的开发过程中，颗粒分析用于配方开发和稳定性测试，以评估pH或辅料对蛋白质聚集的影响因素。 近年来，蛋白质颗粒的免疫原性越来越受到关注。 

以微粒为主要成分的生物制药包括细胞药物产品(CBMP)、病毒颗粒、病毒样颗粒(VLP)、灭活和减毒病毒以及脂质纳米颗粒(LNP)。CBMP是一种新兴药物类别，为癌症、免疫紊乱和遗传疾病等严重疾病提供治 疗选择。 一般来说，CBMP是活细胞，可以来自自体(患者)或同种异体(健康供体)的材料。 病毒除了长期用于经典的疫苗接种方法外，越来越多地作为基因治 疗的病毒载体、核酸疫苗的载体或癌症治 疗中的溶瘤病毒。 病毒载体包含带有用于基因治 疗和核酸疫苗的治 疗性转基因的重组病毒基因组。 根据病毒载体的不同，治 疗基因的表达可以是短暂的，也可以是长期的。 溶瘤病毒被设计成直接或通过溶解肿瘤血管靶向并破坏肿瘤细胞，还可以激活抗肿瘤免疫反应或传递治 疗基因。VLP是一种重要的亚单位疫苗，也被开发为药物传递系统。VLP类似于将其基因组包裹在蛋白质衣壳或磷脂包膜内的病毒，但它们缺乏遗传物质，因此没有传染性。LNP是用于传递核酸(如siRNA和mRNA)的纳米颗粒。 它们与脂质体(内部为液体的磷脂双层纳米颗粒)的不同之处在于，它们有一个充满脂质和活性分子的固体核心。 核酸被阳离子或可电离的阳离子脂质包围。 磷脂和胆固醇(辅助性脂质)增加了固体核心的结构，纳米颗粒通过单层PEG -脂质缀合物稳定。LNP的确切结构可能取决于脂质组成、核酸的类型和浓度以及制备方法。 

由于生物制药的异质性，以及分析的目的/范围和分析技术的选择是高度相关的，往往需要结合几种理想的正交技术。 此外，药品开发的各个阶段需要分析方法的特定特性，以确保一个阶段的应用适当。 重 点从早期开发阶段的低样本消耗、高通量和自动化能力转移到后期开发和发布测试阶段的方法的稳定性指示特性、鲁棒性、结果的统计相关性，以及在规范环境中使用的易用性(质量控制(QC)友好性)。 对于发布测试来说，关注CQA就足够了，因为产品在开发过程中已经被很好地描述了，并且适当的控制策略已经就位。 例如，对于蛋白质药物，测试通常包括SEC的低聚物分析、浊度(通常由亚微米颗粒和/或可逆自关联相关的影响引起)、光阻法(LO)的亚可见颗粒分析和可见颗粒的目视检查。 亚微米颗粒方法经常用于扩展产品表征和问题排除; 检测结果相对较低的鲁棒性是在质量控制应用中未遇到的挑战。 实验室间和跨行业的研究在展示几种颗粒检测技术的性能和局限性方面变得非常有价值。 关键是能够在产品开发阶段能够选择正确的方法来进行正确的应用。

油浸流式成像显微镜 (OI-FIM)

OI-FIM是Yokogawa Fluid Imaging Technology Ltd. 研发的FlowCam Nano流动成像显微镜（FlowCam）系列的延伸。 与其他流动成像显微镜相比，它能够探测粒径范围更小的颗粒，约为0.3 - 10mm。 这是通过使用光圈1.4和蓝色发光二极管(LED)作为光源的油浸技术实现的 与其他流动成像显微镜类似，颗粒表征基于高分辨率图像，从图像中可以检索到每个颗粒的40多个不同的形态参数，例如几种类型的直径、形状、光强度和透明度。 该仪器可以用于各种来源的粒子的大小、形态表征和量化。FlowCam Nano是一个重要的显微检测工具，以缩小亚微米(和低微米)颗粒分析领域的分析差距。 目前，基于形态参数的颗粒识别下限为约2微米。 也可以通过使用AI机器深度学习工具来识别更小的硅油滴和蛋白质聚集物。 

AI 机器深度学习

许多颗粒分析技术，如流式成像显微镜(FlowCam)，成像流式细胞术或拉曼光谱获得大量数据。 为了增加从这些数据中提取更有效的信息，可以使用机器学习工具。 一般来说，机器学习是基于检测数据模式的算法，然后可以用来构建模型，对未知数据进行预测。 有几种方法，如监督学习或非监督学习，适用于药品开发。

机器学习可用于了解生物制药的颗粒形成，以适应药品生产或提供有关其正确处理的建议。 近年来，机器学习的应用成功地提高了蛋白质治 疗学在粒子分类方面的特性，以及蛋白质聚集的根本原因分析。 

FowCam及AI 机器深度学习在 CBMP（细胞治 疗药物）中的应用

对CBMP的鉴定包括细胞活力、鉴定和纯度等方面。 一般来说，细胞样本可能含有活的、凋亡的、死亡的细胞或碎片。 除台盼蓝外，其他一些染料也能对凋亡或死亡细胞进行染色，随后用荧光显微镜或流式细胞仪对其进行分析。  此外，Grabarek等人开发了一种基于FIM的方法，使用CNN来区分活细胞、死细胞和细胞碎片。 

FIM特别适合用来拍摄高分辨率图像用来对于样品中细胞和其他颗粒成分进行分类。并可以在仪器软件中使用Filter（颗粒形态筛分），以区分细胞、细胞碎片和过程相关的杂质，如硅油液滴、玻璃和橡胶颗粒。 此外，与传统的FIM分析方法相比，AI机器深度学习工具可以提高FIM图像中细胞、碎片、聚集物和磁性珠，以及潜在的其他颗粒杂质的识别能力。

总结

目前，可用于生物制药的表征颗粒分析技术很多。 应该根据产品类别和分析范围来选择合适的颗粒分析方法，如杂质与活性药物成分或药物传递系统本身。 

十年前，生物治 疗制剂中的颗粒分析主要集中在“不需要的”颗粒(蛋白质聚集物、杂质、初级包装相关颗粒)，然而今天的颗粒分析需要包括“需要的”颗粒(例如，CBMP、病毒颗粒、VLP、LNP和疫苗)。 由于现有的技术有不同的优点和缺点，因此通过理解各种技术基本的度量原则来确定所选择技术合理性，以及考虑如何将它们组合使用是至关重要的。 

新出现的产品，如CBMP和病毒颗粒产品，也需要对颗粒进行明确的区分和识别。 到目前为止，应用于CBMP的分析粒子表征工具箱仅限于少数几种技术，其中大多数起源于经典的细胞培养。 由于CBMP需要满足与经典生物治 疗相似的安全性要求，因此需要进一步的分析开发。 

尽管最近的技术已经被开发用来缩小“亚微米粒子”距离，特别是与蛋白质治 疗相关的，但是对于这个尺寸范围，仍然只有很少的技术可用，所有的技术都有特定的局限性。 复杂纳米制剂的发展，如LNP, VLP和病毒颗粒，带来了新的分析挑战。 此外，在尺寸、成分、来源和功能方面分析非均匀颗粒仍然具有挑战性，只有少数技术可用来识别颗粒。 

AI 机器深度学习工具在区分各种粒子类别方面具有重要价值，同时也提高数据评估水平。 

随着产品复杂性的增加，应采用适当的技术组合进行颗粒分析。 这种方法的组合需要涵盖从纳米到微米的大尺寸范围内的大小、量化和表征的所有方面。 由于测量结果取决于所使用的技术，因此需要使用正交方法来确认结果并获得对粒子特性的良好理解。 最 后但又是最要的是，根据预期的目的选择适当的技术是高度相关的。 蛋白质药物开发的问题排除分析与病毒样颗粒的表征有不同的分析要求。 必须定义每个产品类别的关键质量属性，以便开发合适的分析技术，以保证药品的安全。 

总之，颗粒分析在生物治 疗中是非常重要的。实现现有的技术与AI人工智能的相结合，将会是开创性的解决方案。