USP mRNA草案2.0来了，看CAD如何助力脂质体的检测？

mRNA疫苗

2020年初，随着新型冠状病毒疫情在全 球各地爆发，世界卫生组织（WHO）将此疫情定性为大流行。时至今日，全 球疫情防控已取得了阶段性的重大进展，我们又回到了2020年前“自由”出入商场、医院等场所的日子。新型冠状病毒疫苗的研发生产对于缩短病毒传播进程，减少患者重症率的作用“功不可没”。目前已上市的新型冠状病毒疫苗主要分为传统灭活病毒疫苗、病毒载体疫苗和mRNA疫苗。其中，mRNA疫苗的关注度相对更高，因其能够快速地更新迭代以应对不断出现的变异毒株，其生产过程短，只需要60-70天，且mRNA疫苗的保护率极高，能达到90%。但由于mRNA在人体内稳定性较差，为了确保mRNA疫苗充分发挥作用，关键技术之一就是递送载体，当前最常使用的递送载体LNPs主要由阳离子脂质、胆固醇、PEG化脂质和DSPC等成分构成。

图1. Moderna和BioNtech的mRNA疫苗使用的脂质体

如图1所示，常用的脂质体成分缺少明显的生色团，因此无法用传统的紫外-可见光检测器、二极管阵列检测器或者荧光检测器进行检测，而传统的示差折光检测器、蒸发光散射检测器等通用型检测器灵敏度、线性范围、响应一致性及稳定性等结果不尽如意。

赛默飞特色的通用型检测器CAD（图2）因其有着较高的灵敏度、较宽的线性范围、较好的响应一致性、较稳定的运行能力等优势，非常适合不挥发或者半挥发化合物的分析，尤其是没有紫外吸收化合物的检测，因此也被2020年中国药典收录进了0512通则。

图2. 赛默飞CAD检测器（左:Vanquish CAD系列, 右：Corona Veo系列）

随着越来越多的疫苗厂家选择CAD检测器进行mRNA递送载体的检测，美国药典USP在今年4月30日发布了“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”2.0版本草案。该草案明确写明脂质表征和含量测定使用CAD检测器。

文献报道[1]流动相的pH值会影响阳离子脂质的保留时间，本实验利用Vanquish core和CAD研究了不同pH流动相对阳离子脂质保留时间的影响，建立了更合适的方法进行脂质的分离。

Vanquish系列液相的高压二元泵具有6个溶剂通道，分别为A1、A2、A3和B1、B2、B3，可以灵活便捷的切换流动相通道进行多种流动相组合，非常便于方法开发时流动相条件的筛选，因此本实验采用Vanquish的高压二元泵（Binary pump）进行方法开发。

仪器配置：

Vanquish Core Binary系列

泵： Binary pump C

自动进样器：Split Sampler C

柱温箱： Column Compartment H（Forced air，被动预热）

检测器：Charged Aerosol Detector H

变色龙色谱管理软件 Chromeleon CDS 7.3

分析条件：

分析柱： Acclaim 300Å C18 150×2.1mm，3.0 μm (PN:060264 )

检测器：蒸发温度：50 ℃，采集速率：5 Hz，过滤器：3.6 s

柱温：50 ℃（配被动预加热）

进样量：10 µl

流速：0.4 mL/min

流动相：详见下表1

表1. 方法开发考察的流动相条件

注：TEAA缓冲液配制：配制3份10%三乙胺水（10mL三乙胺：90mL超纯水）溶液，分别用乙酸调节pH值为4.0/5.5/7.0。

实验结果：

1. 不同pH的影响：

相同的流动相梯度（分析时间28分钟），考察不同pH对脂质分离的影响，见图3和图4，两种不同配方的脂质，在pH4.0时，阳离子脂质和PEG化脂质分离度差；在pH5.5时，两种不同配方的4种脂质分离度非常好；在pH7.0时，SM102配方的脂质分离度良好，但是ALC-0135配方的脂质，在4个脂质的浓度均为10ppm情况下，ALC-0135和DSPC的分离度为1.77。考虑到有的脂质含量比较高，线性范围会很宽，因此选择pH5.5的流动相做后续实验优化。

图3. SM-102、胆固醇、PEG2000脂质、DSPC的谱图

图4. ALC-0135、胆固醇、ALC-0159、DSPC的谱图

2. 优化梯度的结果：

优化梯度后色谱结果见图5（分析时间20min），图6为脂质浓度1ppm到25ppm的标准曲线图及线性相关系数。

图5. ALC-0135、胆固醇、ALC-0159、DSPC的谱图

图6. 胆固醇、ALC-0159、ALC-0135和DSPC标准曲线图

3. 重复性和回收率结果：

重复性：浓度均为5ppm的脂质3针重复性结果见表2，重复性好。

表2. 浓度均为5ppm的脂质3针重复性结果

回收率：将样品用无水乙醇稀释适当倍数及加入标准品，使得最 终样品中含加入的标准品浓度均为5ppm，色谱结果见图7，回收率分别为：胆固醇为100.5%，ALC-0135为104.0%，ALC-0159为101.5%，DSPC为103.5%。

结论：

利用Vanquish的高压二元泵系统的多溶剂通道快速筛选合适的流动相条件，最 终确定选用pH5.5的TEAA流动相条件来分析SM102配方脂质和ALC-0135配方脂质。利用优化的色谱条件（分离时间20min）进行ALC-0135配方脂质的标准曲线测定、重复性、回收率测试，4种脂质的在浓度1ppm-25ppm范围内，线性相关系数均大于0.999，保留时间和峰面积重复性良好，回收率良好。

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