- 2023-05-22 10:20:02 来源:赛默飞色谱与质谱中国 浏览量:260次
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mRNA疫苗
2020年初,随着新型冠状病毒疫情在全 球各地爆发,世界卫生组织(WHO)将此疫情定性为大流行。时至今日,全 球疫情防控已取得了阶段性的重大进展,我们又回到了2020年前“自由”出入商场、医院等场所的日子。新型冠状病毒疫苗的研发生产对于缩短病毒传播进程,减少患者重症率的作用“功不可没”。目前已上市的新型冠状病毒疫苗主要分为传统灭活病毒疫苗、病毒载体疫苗和mRNA疫苗。其中,mRNA疫苗的关注度相对更高,因其能够快速地更新迭代以应对不断出现的变异毒株,其生产过程短,只需要60-70天,且mRNA疫苗的保护率极高,能达到90%。但由于mRNA在人体内稳定性较差,为了确保mRNA疫苗充分发挥作用,关键技术之一就是递送载体,当前最常使用的递送载体LNPs主要由阳离子脂质、胆固醇、PEG化脂质和DSPC等成分构成。
图1. Moderna和BioNtech的mRNA疫苗使用的脂质体
如图1所示,常用的脂质体成分缺少明显的生色团,因此无法用传统的紫外-可见光检测器、二极管阵列检测器或者荧光检测器进行检测,而传统的示差折光检测器、蒸发光散射检测器等通用型检测器灵敏度、线性范围、响应一致性及稳定性等结果不尽如意。
赛默飞特色的通用型检测器CAD(图2)因其有着较高的灵敏度、较宽的线性范围、较好的响应一致性、较稳定的运行能力等优势,非常适合不挥发或者半挥发化合物的分析,尤其是没有紫外吸收化合物的检测,因此也被2020年中国药典收录进了0512通则。
图2. 赛默飞CAD检测器(左:Vanquish CAD系列, 右:Corona Veo系列)
随着越来越多的疫苗厂家选择CAD检测器进行mRNA递送载体的检测,美国药典USP在今年4月30日发布了“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”2.0版本草案。该草案明确写明脂质表征和含量测定使用CAD检测器。
文献报道[1]流动相的pH值会影响阳离子脂质的保留时间,本实验利用Vanquish core和CAD研究了不同pH流动相对阳离子脂质保留时间的影响,建立了更合适的方法进行脂质的分离。
Vanquish系列液相的高压二元泵具有6个溶剂通道,分别为A1、A2、A3和B1、B2、B3,可以灵活便捷的切换流动相通道进行多种流动相组合,非常便于方法开发时流动相条件的筛选,因此本实验采用Vanquish的高压二元泵(Binary pump)进行方法开发。
仪器配置:
Vanquish Core Binary系列
泵: Binary pump C
自动进样器:Split Sampler C
柱温箱: Column Compartment H(Forced air,被动预热)
检测器:Charged Aerosol Detector H
变色龙色谱管理软件 Chromeleon CDS 7.3
分析条件:
分析柱: Acclaim 300Å C18 150×2.1mm,3.0 μm (PN:060264 )
检测器:蒸发温度:50 ℃,采集速率:5 Hz,过滤器:3.6 s
柱温:50 ℃(配被动预加热)
进样量:10 µl
流速:0.4 mL/min
流动相:详见下表1
表1. 方法开发考察的流动相条件
注:TEAA缓冲液配制:配制3份10%三乙胺水(10mL三乙胺:90mL超纯水)溶液,分别用乙酸调节pH值为4.0/5.5/7.0。
实验结果:
1. 不同pH的影响:
相同的流动相梯度(分析时间28分钟),考察不同pH对脂质分离的影响,见图3和图4,两种不同配方的脂质,在pH4.0时,阳离子脂质和PEG化脂质分离度差;在pH5.5时,两种不同配方的4种脂质分离度非常好;在pH7.0时,SM102配方的脂质分离度良好,但是ALC-0135配方的脂质,在4个脂质的浓度均为10ppm情况下,ALC-0135和DSPC的分离度为1.77。考虑到有的脂质含量比较高,线性范围会很宽,因此选择pH5.5的流动相做后续实验优化。
图3. SM-102、胆固醇、PEG2000脂质、DSPC的谱图
图4. ALC-0135、胆固醇、ALC-0159、DSPC的谱图
2. 优化梯度的结果:
优化梯度后色谱结果见图5(分析时间20min),图6为脂质浓度1ppm到25ppm的标准曲线图及线性相关系数。
图5. ALC-0135、胆固醇、ALC-0159、DSPC的谱图
图6. 胆固醇、ALC-0159、ALC-0135和DSPC标准曲线图
3. 重复性和回收率结果:
重复性:浓度均为5ppm的脂质3针重复性结果见表2,重复性好。
表2. 浓度均为5ppm的脂质3针重复性结果
回收率:将样品用无水乙醇稀释适当倍数及加入标准品,使得最 终样品中含加入的标准品浓度均为5ppm,色谱结果见图7,回收率分别为:胆固醇为100.5%,ALC-0135为104.0%,ALC-0159为101.5%,DSPC为103.5%。
结论:
利用Vanquish的高压二元泵系统的多溶剂通道快速筛选合适的流动相条件,最 终确定选用pH5.5的TEAA流动相条件来分析SM102配方脂质和ALC-0135配方脂质。利用优化的色谱条件(分离时间20min)进行ALC-0135配方脂质的标准曲线测定、重复性、回收率测试,4种脂质的在浓度1ppm-25ppm范围内,线性相关系数均大于0.999,保留时间和峰面积重复性良好,回收率良好。
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USP mRNA草案2.0来了,看CAD如何助力脂质体的检测?
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