采用色谱技术并基于电泳滴定和电容耦合非接触电导检测测定人源血清总蛋白

概括

血清总蛋白含量的检测与人体健康监测和疾病诊断密切相关。 本文基于电泳滴定（ET）技术结合电容耦合非接触式电导检测（C4D）技术，实时捕捉通道内物质在ET过程中的电导率变化，在不依赖指示剂的情况下和光学检测设备，对人血清总蛋白含量进行定量检测，ET-C4D总检测时间约为300 s。 在本文中，人血清白蛋白（HSA）标准品被用作模型蛋白。 与聚丙烯酰胺凝胶（PAG）母液、核黄素等混合后，在紫外光下照射10分钟聚合形成凝胶，进行ET实验。 与ET管道外壁耦合的非接触式电导率检测电极在电泳过程中捕获通道内材料的电导率信号。 经过检测模块和数据采集卡处理后，发送至计算机。 开发的分析和测试软件根据电导率信号进行定量。 分析结果表明:线性范围为0.25~3.00 g/L,线性拟合度(R2)在0.98以上,检出限(LOD)为0.01 g/L,相对标准偏差为1.90%, 0.50 g/L的测试值与HSA标准实际值的相对误差小于7.20%，表明检测系统具有良好的检测稳定性和灵敏度。 最后检测人体实际血液样本中血清总蛋白含量，并建立相应的总蛋白标准曲线。 然后选取4名志愿者的血清样本进行ET-C4D检测，并将ET-C4D检测结果与双缩水试验进行比较。 对尿素法的检测结果进行对比，两种方法检测结果的相对误差在4.43%以内，进一步证明了检测系统的准确性和可用性，以及检测系统在临床即时检测（POCT）领域。 值和生化分析值。

溶液配制

阴极电解液：200mmol/L NaOH； 阳极液：20mmol/L KCl； ET通道含有12 μL固定液； 模型蛋白原液：配制100 g/L HSA溶液，置于4℃冰箱保存备用； PAG储备液：将28.8g丙烯酰胺和1.2g双丙烯酰胺溶解于水中并定容至100mL。

固定剂的制备：ET过程利用凝胶将大分子蛋白质固定在通道中。 本文利用光聚合作用使凝胶聚合，从而使蛋白质固化。 第一步，制备 5 mL 凝胶原液：包括 3.125 mL PAG 原液、40 μL 酚酞（1%，质量分数）、62.5 μL KCl 原液（200 mmol/L）、25 μL饱和核黄素溶液 (0.12 mg/mL) 和 0.2 μL TEMED。 第二步，制备含有不同待测蛋白的固定液：取0~20 μL HSA储备液（100 g/L水溶液）与320 μL凝胶储备液混合，得到含有HSA的浓度梯度（0.01、0.05、0.25、0.75、1.5、3、5 g/L）固定剂。

血样前处理：用EDTA抗凝管采集5mL静脉血，将血液放入离心机中4000r/min离心5分钟，吸取上清液，然后将上清液加入超滤浓缩离心管中。 5000 r/min离心20 min，除去滤液，加入与滤液等体积的2 mmol/L KCl溶液至超滤管中，保存于-20℃冰箱备用。

缩二脲法

参考文献，将采集的静脉血放入离心机中4000 r/min离心5 min，提取上清液，采用缩二脲法测得5名志愿者样本的血清总蛋白浓度为71.0。 、73.0、75.0、77.0、78.0 克/升。

ET-C4D检测原理及定量计算方法

向 ET 管中加入 12 μL 固定液，在紫外灯下均匀照射 10 分钟，形成凝胶。 凝胶凝固后，施加 ET 电压并开始 ET 电导信号监测。 ET-C4D的原理和输出信号如下图所示： 图a中，在通电之前，蛋白质均匀地固定在电泳通道中。 通电后，阴极电池中的OH-在电场的作用下向阳极端迁移并被取代。 原背景溶液中存在Cl-，但在迁移过程中蛋白质消耗了部分OH-，同时K+迁移至阴极端，导致ET界面前逐渐形成低离子浓度区域。 当低离子浓度区域进入电导率检测区域时，电导率信号继续下降； 但随着ET逐渐进行，由于OH-完全取代了原来的Cl-，导致ET末端区域的pH值急剧上升，导致蛋白质表面电荷增加，同时该区域的K+浓度升高迅速上升以保持电中性。 ，原来的低离子浓度区域逐渐被高离子浓度区域取代，电导率随之回升。 整个变化的电导率趋势如图b所示。 不同含量的蛋白质具有不同数量的滴定点，导致下降沿的幅度不同。 根据ET原理，蛋白质浓度越高，界面迁移速度越慢，电导率下降到波谷的时间也会滞后。 因此，随后，可以使用下降曲线数据来定量待测蛋白质的浓度。

图b给出了ET-C4D的定量计算方法，其中Δσ代表电导率基线值与波谷的差值，T代表电导率波谷对应的时间。 上述物理量可在后续实验应用中通过绘制标准曲线，对人血清总蛋白含量进行定量。

综上所述

本文提出一种基于ET技术和非接触式电导检测技术的ET-C4D检测系统，用于HSA和人血清总蛋白的检测。 结果表明，该检测方法分析性能良好，时间短，可在300 s内实现蛋白质的快速检测，且具有较高的灵敏度和稳定性； 通过检测真实的人血清样本并计算总蛋白含量，证明了该方法的临床应用价值。 与传统方法相比，该方法操作简单，不需要添加特定的标记试剂，也不依赖专业的光学检测设备。 检测结果可用于定量分析，分析性能优良，准确度高，在生物分析领域具有较高的应用前景。 潜在的。