离子相互作用分子量结果不稳定？以NaCMC为例展示APC方法开发流程

羧甲基纤维素钠(NaCMC)是⼀种⽔溶性且⽆毒的生物聚合物，⼴泛应用于各行各业的不同产品中。它的增稠性、机械性能和粘弹性受分子量和取代度的影响，这些特性又会影响溶解度。将NaCMC加⼊产品中之前，进行适当的表征对于确保理想性能至关重要。

测定NaCMC的MW及其分布，Z 常用的是传统的体积排阻色谱(SEC)法。然而，传统的SEC测定通常需要较长运行时间，且由于粒径较⼤以及仪器相关的谱带展宽的影响，分离度较低，导致对细微MW异质性的灵敏度通常不高。另外，鉴于离子性质，寻找适合用于表征的流动相并非易事。超高效聚合物色谱ACQUITY APC（Advanced Polymer Chromatography）分离则克服了这些不足，已成功用于表征生物基和半合成聚合物。

基于APC研究溶剂诱导的离子相互作用样品描述

样品组包含两种不同粘度的五个NaCMC样品。NaCMC 1和2为⾼粘度样品，NaCMC 3到5为中等粘度样品。取100mg NaCMC溶于10 mL去离⼦⽔中，在80°C (70 rpm)的线性振摇⽔浴中溶解1小时。将溶液冷却⾄室温，然后⽤洗脱液稀释，制备1 mg/mL的样品溶液。

Step 1

使⽤去离⼦水作为流动相。如下图所示，在相同的保留时间范围内，5个NaCMC样品以近似的死体积(V0)洗脱，形成带毛刺和肩峰的窄峰。NaCMC在⽔中的这种洗脱行为是聚合电解质在低离子强度极性溶剂中的典型表现。这些电荷效应与固定相类型⽆关，因为以⽔为洗脱液时，NaCMC的洗脱行为与在凝胶色谱柱上观察到的相同。

图1. 以⽔作为流动相分析得到的NaCMC1-5的RI叠加⾊谱图。

为了减轻NaCMC的聚电解质效应，⽅法开发⼯作流程的后续步骤主要包括改变pH值、添加盐等。

Step 2

以pH 5的乙酸盐缓冲液作为洗脱溶剂。如下图所示，样品峰的保留时间略有增加，第⼀个峰对应NaCMC（主峰），而5-6 min之间的峰通过叠加样品和空白谱图判断为洗脱液的峰。主峰突然急剧上升表明有很大一部分样品从Z 大的色谱柱孔中排出，从而未分离。基于之前的研究，NaCMC会在缓冲溶液中形成缔合物，可能是色谱图中峰急剧上升的原因。水溶性多糖，特别是带电多糖的⽆缔合物溶液制备是SEC分析普遍的问题。另外，谱图中样品NaCMC2、4和5在保留时间3.5-5分钟之间可能存在第二个峰群。但总的来说，目前流动相条件不够充分，且辨别能力不足。

2. 利⽤pH 5的乙酸盐缓冲液分析所得的NaCMC样品的RI叠加图。

Step 3

考察了pH 8.8的NaOH稀释溶液，同时降低流速到0.5 mL/min。峰形较之前测试的流动相有所改善。但由于高pH值对螺旋聚合物链形状的影响不同，相互作⽤的类型也不同，尽管峰形表⾯上看起来更⼀致，但⾼pH值的流动相并没有区分出不同粘度的5个样品。此外，在低pH值的⼄酸盐缓冲液中观察到的第⼆个峰群在⾼pH值的流动相中也没有得到分离。

图3. 利⽤pH 8.8的NaOH稀释液分析所得的NaCMC样品的RI叠加图。

Step 4

在明确高、低pH值的流动相均不能充分抑 制聚电解质典型⾏为的情况下，研究了使⽤中性pH的磷酸盐-硝酸盐流动相且提⾼盐量的影响。此外，将之前的实验中使⽤的AQ 45Å替换为AQ 125Å⾊谱柱。分离在11分钟内完成。从下图可以看出，除NaCMC1外，其他样品分为两组。这表示NaCMC1中低分⼦量组分的丰度不如其他样品明显。结果表明，使⽤含盐的中性pH流动相可以减少NaCMC与⾊谱柱填料之间的相互作⽤。

图4. 利⽤pH 7的0.2 M NaH2PO4/0.01 M NaNO3分析所得的NaCMC样品的RI叠加图。

结果

所有NaCMC的测定分⼦量见下表。样品的相对标准偏差(RSD)计算值<4.5，表明测量结果具有良好的重现性，也表明聚合物链不存在潜在降解，因为降解会使信号（色谱图）的重现性降低，从而导致RSD值较高。

结果如预期⼀样，⾼粘度样品NaCMC1和2的Z ⾼重均分⼦量(MW)在900-1000 kDa范围内，中等粘度样品的MW在700-750 kDa范围内。比较测试的四种流动相，中性pH流动相与AQ 900Å+450Å+125Å⾊谱柱相结合对NaCMC样品的分离效果Z 好。

总结

由于被测流动相与聚合物之间的离⼦相互作⽤，我们观察到显著不同的色谱响应。在此次NaCMC样品分析中，聚电解质效应随流动相中盐含量的增加而减小，而pH值在降低聚合物与聚合物的相互作⽤方面作⽤较小。中性pH和较⾼的盐度尽可能地减小了离⼦相互作⽤，并得到理想的色谱性能。

优势

• APC被证明是⼀种⾼效、快速开发⽅法的有用⼯具；
  

• BEH AQ⾊谱柱可以在较宽的pH范围内产⽣低RSD的可重现结果；

• APC系统能够为水溶性生物聚合物中溶剂诱导的离⼦相互作⽤研究提供便利。