小牛肠碱性磷酸酶&虾碱性磷酸酶，傻傻分不清楚?

分子克隆，一个大家做实验必经的实验流程。我们可以通过分子克隆将所需的目的基因连接到载体上，最后导入表达系统中进行表达。分子克隆包含：目的基因扩增、载体线性化、连接以及转化筛选。说到载体线性化，除了PCR线性化载体，大多数小伙伴会选择酶切进行载体线性化。对于一些单酶切位点的线性化载体，我们常常需要碱性磷酸酶进行载体去磷酸化。

碱性磷酸酶，可以将DNA、RNA的5’端磷酸基团去除，常用于阻止载体的自连作用，也可用于酶法化学发光。在分子克隆实验中，DNA连接酶催化DNA连接时需要有磷酸基团的存在，载体在经酶切后会在切点端保留一个磷酸基团。而载体经碱性磷酸酶去磷酸化后因5’端无磷酸基团，因而不可以和自身3’-端连接。因此连接反应中载体本身会优先发生的连接反应被阻止，提高了目的片段插入率。在我们使用完碱性磷酸酶之后，载体的5’端磷酸基团被去掉，载体自身在普通的连接酶作用下不能进行连接；但载体和片段之间形成3´,5´-磷酸二酯键，连接双链其中的一条，另一条链则靠大肠杆菌自身的修复系统进行连接。

小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）和虾碱性磷酸酶（SAP）都可以去除载体或片段的5’-末端磷酸基团，但失活方法不同。

小牛肠碱性磷酸酶，在底物浓度高时，CIAP的最适pH约为10；底物浓度低时，最适pH约为8，但特异性比高底物浓度时低。同时，其在保存条件下极其稳定，但在螯合剂存在条件下，经65℃、30分钟加热处理99%的活性不可逆失活。失活处理时，建议试用苯酚，从而使酶完全失活。

虾碱性磷酸酶，可以在65℃ 加热 5 分钟的条件下不可逆失活。同时，在进行去磷酸化反应之后，不需要纯化产物，可直接用于后续的连接反应。虾碱性磷酸酶也可以用来降解PCR反应中的游离dNTP，用于制备测序模板和 SNP 分析。同样无需纯化，可直接用于下游实验。

载体线性化后，去磷酸化检测：在我们对线性化的载体使用了碱性磷酸酶进行去磷酸化之后，可以直接将酶切后的载体加上T4 DNA连接酶进行酶连，然后进行转化涂平板并计算菌落数。将酶切后的载体直接进行转化涂平板并计算菌落数。比较没有经过酶连以及经过酶连的两个平板的菌落差异。若两次实验的差异不大那么就证明去磷酸化效率高。

除了两种碱性磷酸酶，翌圣生物还有更多的克隆及克隆筛选相关试剂供您选择。

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