客户成就 | 基于高内涵成像分析系统评价与表征蓝藻细胞特征

您是否关注过水体中悄然滋生的“生态杀手”——蓝藻？作为水华爆发的元凶，蓝藻释放的毒素严重威胁饮用水安全与生态平衡。然而，其细胞微小、形态多样且易受环境干扰的特性，让传统检测方法陷入效率低、误差大的困境：显微镜计数耗时费力，易受主观性干扰 ……

蓝藻 (Cyanobacteria) 是一类广泛分布的光合原核生物，常被称为蓝绿藻，广泛分布在包括湖泊、河流、池塘和海洋等水域环境中，在全球生物多样性和生物地球循环发挥着重要作用。但近些年，人为活动和气候变化，使得有害蓝藻水量大量增加，引起水体水华发生，其中产生的有毒物质（藻毒素），破坏水生生态平衡。因此，对于蓝藻细胞检定和计数、细胞形态评估是水质检测重要组成部分。目前常使用的普通显微镜，利用血细胞计数板可以对常见蓝藻细胞进行检定，由于自然样品中存在的蓝藻细胞存在高度物种多样性、细胞单元复杂的情况，导致计数误差大，种类统计存在差异等诸多挑战^[1]。

蓝藻与其他真核藻类相比，含有自身的光合色素，可以产生自发荧光。蓝藻除叶绿素 a 发生荧光外，还在不同波长可以激发辅助色素，根据不同激发光区分不同藻类群，可以增加蓝藻细胞的特异性识别^[2-3]。蓝藻细胞中色素主要由藻蓝蛋白和藻红蛋白组成的藻胆蛋白产生，这些蛋白具有很强的荧光且不干扰叶绿素荧光。通过蓝藻蛋白以及叶绿素的荧光强度测定，可应用于检测蓝藻生长变化，测定水中蓝藻细胞的浓度，为蓝藻生长代谢提供定量化数据。

在这里，我们通过蓝藻具有自发荧光的特性，利用 ImageXpress?Micro?Confocal 共聚焦高内涵 (Molecular?Devices) ，对蓝藻细胞中的叶绿素和藻蓝蛋白进行多通道高通量成像，利用 MetaXpress 软件可以分析不同细胞内荧光强弱，判断蓝藻细胞数量，计算包含蓝藻细胞大小等多特征在内的形态指标。这种利用高内涵对蓝藻进行形态学观察与测定、数量统计可建立高通量测定和评价蓝藻的检测与评估方法，为蓝藻的机制研究或日常评价检测提供一种有效、快速的手段。

将培养基中铜绿微囊藻、鱼腥藻按一定比例稀释，分别加入到 96 孔微孔板中，使用 60x 水镜进行 Z 轴成像，用高内涵批量采集 TL10（明场）、CHLA（自定义的叶绿素荧光通道，激发波长：410-430?nm；发射波长：685?nm）、Texas??Red（藻蓝蛋白荧光通道，激发波长：590-630?nm；发射波长：650??nm）通道。从图 1 铜绿微囊藻成像结果上可以直接观察到蓝藻细胞的生长状态与分布情况，形态以圆球形为主，可观察到铜绿微囊藻内有叶绿素和藻蓝蛋白的荧光表达。图 2 成像结果上可以观察到鱼腥藻为丝状结构，每条丝的长短不同，且每条丝上有不同个数的圆形细胞。在明场下可观察到细胞形态，荧光通道下细胞内的叶绿素和藻蓝蛋白荧光表达情况。

利用高内涵配备的分析软件 MetaXpress 的 custommodule editor (CME) 模块定量藻类细胞的形态。在 TL 明场、CHLA、Texas Red 两个荧光通道下，可以识别铜绿微囊藻的细胞在视野中单个蓝藻细胞个数、细胞面积、细胞直径、细胞圆度等参数（图 3，表 1）。在鱼腥藻识别中，CME 模块下，可以识别视野内鱼腥藻的个数，鱼腥藻长度，每个鱼腥藻上细胞的个数，细胞面积、直径与圆度等参数（图 4，表 1）。可作为批量观察与分析不同光强、不同温度或不同培养基配比条件下，定量藻类生长个数、大小的变化等形态学参数指标。

藻类生长中都含有叶绿素，而藻蓝蛋白是蓝藻细胞中特有的辅助色素，有很强的荧光且不受叶绿素干扰，在低浓度下，藻蓝蛋白荧光强度与生物量成正比，因而藻蓝蛋白荧光强度的定量监测可测定蓝藻生物量，作为复杂水域蓝藻生物量监测的重要指标。通过高内涵成像后，利用 CME 模块定量 CHLA、Texas Red 两个荧光通道的 Integrated Intensity 和 Average Intensity，通过比较藻蓝蛋白与叶绿素荧光比值可作为快速监测蓝藻生物量的重要方法。

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作为校级教科研服务平台承担学校各类教科研项目的分析测试和研究任务，所有仪器设备均面向校内外提供开放共享服务，中心具有的共聚焦高内涵成像分析系统（ImageXpress Micro Confocal，美谷分子仪器（上海）有限公司）可以在细胞和微组织结构和功能完整性的前提下，对细胞和亚细胞层次进行多通道、多靶点的荧光或可见光的全面扫描，可以进行包括：细胞健康指标分析、彗星检测、细胞毒性分析、微核检测、斑马鱼毒性等检测。