被同门的Co-IP实验「卷」到了！原来是偷偷学习了这些技巧（附实验资料包）

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在实际开展免疫沉淀实验的过程中，会遇到多种技术和实验问题，也有许多实验细节需要掌握。根据多年实战经验，精心总结实验流程、影响因素、问题分析及解决方案等，免疫沉淀实验指南和问题分析手册方便大家个性化、针对性的优化实验。

无论是固体介质类型、抗体固定方法、加样顺序还是结合/洗涤/洗脱缓冲液，任何变量的改变都对实验结果至关重要。以固体介质（支持物类型）为例，实验常用琼脂糖和磁珠的选择有何讲究？

1）交联的琼脂糖是 IP 应用中最常用的微珠支持物。琼脂糖具有更高的结合能力，且性质稳定， 不会受中等含量的多数去污剂、盐、大多数有机溶剂或极端 pH (pH 长期耐受范围为 3-14，不会被大量水解 ) 等条件的影响。

2）磁珠是近几年来颇受欢迎的 IP 固相支持物。因为具有磁性，无需离心，只要配合磁力架使用，即可完成对固相和液相的分离。具有快速、温和、可重复性高以及非特异性低的优势，适用于高通量，自动化分析。但由于磁珠表面积小于琼脂糖珠，单位体积的结合能力会低于琼脂糖树脂。

3）交联的丙烯酰胺 / 双丙烯酰胺树脂是琼脂糖微珠的常见替代物，具有如耐受微生物污染、良好的化学和 pH 稳定性以及非特异结合低的优势，但机械稳定性一般。

1. 纯化所得抗原量低

1）抗原结合水平低

IP 应用中出现低抗原结合水平的可能原因有很多，结合反应所使用的溶液是重要原因之一。必须使用适合的缓冲液，有特定的 pH 和盐浓度，可能还需要添加互作所需的辅助因子。

IP 或 Co-IP 中用于纯化的抗体是影响得率的另一个重要因素。尽量选择稳定、结合力强且经验证过的抗体。Invitrogen高级验证抗体经过至少一种方法（基因敲除或敲低，IP-MS，细胞处理等）验证，保障与靶标正确结合。

2）抗原洗脱水平低

在某些情况下，抗原与抗体或结合蛋白结合之间可能会发生极强的相互作用，传统的洗脱缓冲液无法将其破坏。如果抗原产量很低且怀疑抗原仍然结合在微珠支持物上，解决方案如下：用剧烈的缓冲液 ( 如 SDS-PAGE 上样缓冲液 ) 来煮沸少量微珠，然后离心微珠，再采用 SDS-PAGE/ 蛋白质免疫印迹分析上清，确认上清是否存在抗原。如果存在抗原，则应尝试其他强度更高的洗脱缓冲液，以确保抗原不会被灭活的洗脱条件。

2. 纯化所得抗原纯度低

1）非特异性蛋白污染

如果洗脱所得抗原纯度较低，则有几种方法可以进行优化：①在结合或洗涤缓冲液中加入去污剂或其他可以降低非特异性结合的组分。②使用普通微珠预纯化样本。③使用无关蛋白 ( 如 BSA) 封闭微珠 。④使用温和的缓冲液。

2）抗体污染

使用蛋白 A、G 或 A/G 的经典免疫沉淀实验中会出现抗体与抗原共洗脱的情况。如果共洗脱会影响下游分析，则需要使用抗体通过共价连接固定至微珠的方法进行实验。