强强联合 | 自动化助力10x Genomics单细胞转录组高通量趋势

2023-12-15 13:21:10 107阅读次数

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RNA测序（RNA-seq）是转录组水平分析基因表达差异和mRNA剪接差异不可或缺的工具。RNA-seq方法可应用到许多方面，包括单细胞基因表达、翻译组、RNA结构组和空间转录组学。其中单细胞转录组测序（scRNA-seq）是传统RNA-seq工作流的一个转折点，该技术将对细胞基因表达的分析推进到了单细胞层次，允许研究人员分析混合细胞群中的微小差异，其中可能只有一小部分细胞驱动观察到的表型。scRNA-seq方法还允许根据单细胞的转录组对单个细胞进行聚类，从而可以检测罕见的细胞类型以及细胞群如何随时间变化或对药物的反应。

scRNA-seq的基本工作流程是将细胞群分离成单个细胞，分离其mRNA，通过逆转录生成标记的cDNA，制备测序文库，然后进行标准的短读长测序。随着人们对scRNA-seq的兴趣日益浓厚，已经开发了多种技术来满足用户的需求。Z流行的方法之一是 10x Genomics Chromium 单细胞转录组3'基因表达试剂盒。该试剂盒的工作流程如图 1 所示。简而言之， 10x Chromium 单细胞系统基于Next GEM技术，将带有细胞条形码标签的凝胶珠与细胞、酶以及分液油混合，产生成千上万个单细胞乳液微滴，这些微滴被称为“GEM”（Gel Bead-in-emulsion）。每个 GEM 作为单独的反应微滴，包含逆转录所需的试剂和使用唯一细胞条形码标记 cDNA 的引物，以及每个 mRNA 分子的唯一分子标识符（UMI）。添加条形码后，来自同一细胞或细胞核的所有片段都共享唯一的相同条形码。随后是GEM的破裂，混合cDNA的扩增，以及用于基因表达分析的测序文库的生成。整个工作流程需要 8 个多小时，仅文库制备过程就可能需要 4 小时，具体取决于样品数量。且文库制备是一个耗时耗力的过程，需要多次磁珠纯化步骤。因此，我们使用 Biomek i7 Hybrid自动化工作站来简化单细胞 cDNA 池生成后的文库制备过程。

图1. 10x Genomics Chromium Single Cell 3'

试剂盒的工作流程

图2. Biomek i7 Hybrid自动化工作站及工作台面

我们开发了一种能够同时制备48 个 scRNA-seq 文库的方法，并进行了手工制备文库对比。首先，使用10x Genomics Next GEM 工作流程从小鼠巨噬细胞的单细胞悬浮液中生成了 6 个带有UMI 条形码的 cDNA 样品，分别使用自动和手动方法为这六个样品制备基因表达文库。我们对比了二者的文库产量和片段大小，自动化制备的文库平均浓度为135 ± 17 nM，平均片段大小为466 ± 7 bp；手动制备的文库平均浓度为 80 ± 5 nM（平均 ± SD），平均片段大小为457 ± 7 bp。在自动化工作流程制备的文库中观察到了更高的摩尔浓度和平均产量（图2），且所有样品中均未观察到由于接头或引物二聚体导致的短片段。这些数据表明使用Biomek i7 Hybrid自动化工作站可以制备高质量的scRNA-seq文库。

图3. 文库产量和片段大小对比

在确定scRNA-seq文库满足测序的质量要求后，进行测序，分析测序数据以评估单细胞QC参数，包括细胞计数、UMI数、基因数和测序饱和度（图3）。自动化与手动制备文库之间，细胞计数的CV约为10%，UMI计数中位数的CV约为11%，检测基因数中位数的CV约为7%。在自动化制备的文库中观察到更高的测序饱和度。分析结果标明，Biomek i7 Hybrid 自动化工作站提高了文库制备的通量，同时保持测序结果与手工制备的文库效果一致。