非变性质谱表征，不止是分子量的故事

使用SNAP方法进行蛋白纯化，最终获得样品为目标蛋白和诱饵蛋白结合的复合物形式，使用非变性质谱分析可获得两者结合的化学计量信息，文中此类的例子很多。例如，作者分别纯化两种增强型绿色荧光蛋白（野生型 EGFP和A206K单点突变体，mEGFP），非变性完整蛋白解析可获得目标蛋白-诱饵蛋白（EGFP-Ab）复合物中的结合化学计量信息（图2）。

图2 纯化的 EGFP 或 mEGFP 与 Ab结合复合物的非变性完整分子量及二级质谱谱图

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为了比较经过 SNAP 方法纯化获取的蛋白与原始形态的蛋白之间的区别，除了分子量层面的对比以外，作者还使用top-down分析的方法对比了两者的碎片信息。捕获得到的生物素-亲和素复合物经过源内碎裂先后释放出诱饵生物素和亲和素蛋白单体，后者再经过 pseudo-MS3进行特定蛋白型（proteoform）的片段分析，从而实现复合物-单体-肽段的全链条top-down分析。图3 展示了SNAP方法纯化的亲和素单体与原始亲和素单体的碎片离子相关性。

图3 比较纯化回收和原始形态的亲和素复合物解离（左）、单体蛋白型分布（中）和pseudo-MS3谱图（右）（点击查看大图）

文中采用SNAP beads方法纯化了人血浆中的结合珠蛋白haptoglobin（Hp），诱饵蛋白使用了血红蛋白hemoglobin（Hb），最终获得了Hp-Hb的复合物（图4A）。Hp肽链长度多样，多个糖基化修饰，不同聚体形态和结合形态，是一个高异质性的糖蛋白。通过非变性质谱的分析可知，4个不同血清样品获取的Hp的聚合形态并不相同（图4B）。在血清中加入游离 Hb（模拟溶血条件），经非变性质谱的分析可知 Hb在 Hp-Hb复合物中的占比（图4C）。此外，由于诱饵Hb蛋白上有一个额外的linker基团，所以相比游离 Hb 蛋白，会产生一个 126 Da的质量偏差。采用进一步的二级碎裂将Hb从Hp-Hb复合物中释放出来，比较两者的谱图可对它们进行区分（图4D）。

图4 使用SNAP-MS 纯化并表征人类血浆中的Hp蛋白

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从图中，我们可以发现，由于高异质性，Hp的质谱图即使是在非变性条件下，仍然呈现很宽的质量数分布，对数据解析引入了很大的挑战。

此时，依然结合在目标蛋白上的诱饵蛋白，可用于减少电荷价态，并进行质量纠正。通过二级质谱碎裂，将Hb诱饵蛋白从复合物中释放出去，可显著降低剩下的目标蛋白的价态、提升价态分辨（图4E），并利用碎裂反应的质量守恒作为约束条件校正传统解卷积算法产生的分子量偏差，有利于谱图的数据解析。

作为一个主要面向蛋白复合物的分析策略，非变性质谱最终需要解决生物医学分析中的问题。尽管质谱对纯度的要求相对较低，非变性质谱的应用多年来仍然主要局限在高度纯化的蛋白以及体外重构的复合物范畴，尚不能作为生物样本乃至临床样本的常规分析手段提供更直接的信息。思维惯性是技术开发和应用中的最大困难，如何与生物医学需求有效对接是我们面临的切实要务。清华大学王建斌教授不仅了解生物学家的需求，对化学分析原理也有很精深的见解，这样的合作促使我们用新思维去尝试提升理论性能到实际价值的转化率。课题也得到清华大学王宏伟教授的大力指导，强化了纯化、质谱和冷冻电镜的对接。合成体系优化以及流程细节验证都导致课题执行周期远超预期，两位一作在文章发表前已经博士毕业，重重压力也是实际需要克服的困难。

我们的目标体系呈现分子量分布宽和异质性高两大特点：目标复合物分子量动辄达到数百万道尔顿（MDa），要求仪器有充分的质量检测范围；大量目标蛋白存在糖基化等复杂修饰，高异质性导致信号难以解析，我们所开发的一系列解决方案也要求仪器具有充分的分辨能力。我在荷兰Heck课题组工作期间参与了UHMR原型机验证，对它的性能有比较早的了解；我们的质谱团队在北大黄岩谊教授支持下购置了国内第一台UHMR仪器，它同时具备的超高质量范围和超高分辨两大性能提供了胜任研究目标的硬件保障。

首先谈不上深远，我们这个课题的初心是能为蛋白结构质谱应用于生物样本乃至临床样本发挥一小步实实在在的推进作用。文章发表只能说明数据结果获得了评阅同行和编辑的认可，技术就绪程度还需要业界的广泛检验。先驱们打出了非变性质谱、top-down组学等结构质谱策略的旗帜，我们希望能作为火把传递的一员为这些技术的普适工具化出一份力。SNAP-MS只是一个开端，我们会继续以实际应用场景作为指引，结合仪器的优势性能，在天然化、原位化的方向上尝试一系列的技术拓展，努力让更多结构质谱方法呼之即来，来则可用。