技术干货 | 四血管阻塞全缺血模型的制作

四血管阻塞全脑缺血模型

缺血性脑损伤是目前中 枢神经系统损伤性疾病研究的热点，建立稳定和易操作的动物模型是缺血性血管病研究的基础。目前研究Z多的是 Pulsinelli大鼠全脑缺血四血管模型，是Z经典的脑缺血动物模型之一，近年来被许多学者所使用。此方法能够有效地模拟临床中出现的因低血压休克及心肺脑复苏而导致的大脑缺血性损伤，且该模型具有较好可重复性，因此大批量用于基础实验。

动物选择

大鼠

 · 对于四血管阻塞模型，比较理想的动物为 Wistar大鼠。品系好坏、是否为同一供应商和动物的周龄是影响实验成功率的几个重要因素。体重在250~300g的年轻大鼠成功率较高，而且四血管阻塞模型稳定性更好。由下表可知，一般选择Wistar大鼠作为实验动物。

小鼠

 · 小鼠体型小，椎动脉分离阻塞困难，因此常采用蒙古沙土鼠。沙土鼠也是Z 早用于全脑缺血研究的动物。沙土鼠的优点是天生缺少两条后交通动脉，因此后循环不会代偿前循环，只需结扎两侧颈总动脉即可实现全脑缺血。但是，因为Willis环存在变异，只有30%-40%的小鼠能成功实现全脑缺血，而75%的沙土鼠在结扎一侧颈总动脉后就会造成心脏骤停。但沙土鼠比较难购买到。

手术操作步骤

1.基本的四血管阻塞模型 

 · 用异氟醚麻醉后，使大鼠平躺在手术台上，用呼吸麻醉维持动物的麻醉状态。

瑞沃德小动物呼吸麻醉解决方案

颈动脉周围放置阻塞设备

(1)颈部腹侧正中划开一伤口，使其皮肤分开。

(2)双手操作小弯镊将覆盖在颈部腹侧的肌肉及其他组织分开，暴露实验动物的颈总动脉。

(3)将迷走神经和颈交感神经链轻轻拨开，分离出颈总动脉，操作期间防止破坏神经。

(4)将阻断装置一根硅管(外径15mm，内径8mm，长10~15cm)分别松散地扣在颈总动脉上，并穿过纽扣的两个小洞。

(5)硅胶管两次穿过塑料管两端，将管子打结，系紧形成一个环。环的长度应该比塑料管的长度要小，这样就可以用来做阻塞装置了。因此，当硅管通过塑料管拉紧后，将和按钮共同阻断颈动脉血流。

(6)用1~2根手术线缝合伤口。

脑血管结构示意图

电凝椎动脉

(1)将大鼠固定在立体定位架上，从颈背枕骨到第2颈椎(长约1cm)做一切口。剥离椎旁肌肉，暴露第1颈椎的翼孔。目的是充分暴露翼孔，可以在大鼠尾部系一根橡皮筋适当拉长颈椎。

(2)把双极电凝器镶嵌进入翼孔，永 久烧灼椎动脉。电凝这一步是缺血成功的关键。如果加热过久会损伤下颈椎脑桥，增加死亡率；反之，若时间过短，不能完全电凝阻断椎动脉，导致缺血不完整。目前，没有十分WM的方法来检测椎动脉是否永 久闭塞。笔者的经验是，利用像注射器针头那样带有尖头的小探头，插入阿拉尔孔，稍微弯曲，如果出血，则需要再电凝一次。也可以用结扎的方式阻断椎动脉。

椎动脉结扎

(a)暴露DY颈椎，显露左侧翼孔(箭头处)

(b)(c)插入电凝器，凝闭左侧椎动脉

(d)显露右侧翼孔(箭头处)

(e)(f)插入电凝器，凝闭右侧椎动脉

(3)缝合伤口，将实验动物放入舒适的笼内休息。

双侧颈总动脉阻塞

(1)第2天继续手术(禁食过夜，同时血糖水平一致)，首先使其露出腹侧颈部。

(2)去除腹侧颈部的手术缝线，牵拉塑料管中的硅管，然后系紧硅管，完全阻止颈总动脉的血流。

(3)验证缺血成功。如果缺血成功，1min后大鼠将失去翻正反射。在整个手术过程中，大鼠体温由一个连有直肠温控探头的加热垫维持在37℃。

(4)阻塞一定时间后，松开系紧的结并恢复血流，这里说的一定时间取决于所要研究的大脑区域，动物将在短时间内恢复血流。

2.四血管阻塞1天模型

(记录缺血去极化状况)

 · 大脑温度是影响缺血后细胞死亡严重程度的关键因素。另一个潜在的因素是头部和颈部肌肉产生的侧支血管。这种改进后的四血管阻塞模型将脑部温度维持在37℃，以缺血去极化为是否完全缺血的指标。

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手术准备

(1)除在管子打结处绑手术缝线外，阻断颈总动脉和电凝椎动脉的步骤与前面所述相同。

(2)在头骨的一侧钻一个洞，目的是放入一个温控探头。

(3)将直径为8mm温控探头轻轻地放入头骨下硬脑膜上，将体温维持在37℃。

(4)在所需要研究的脑部另一侧再打一个洞。海马定位的坐标是前囟前(AP)5.0mm，旁开(ML)2.5mm；纹状体定位的坐标是前囟前(AP)9.5mm，旁开(ML)3.0mm(耳间)。

(5)用尖头镊子剥掉硬脑膜，通过滴加生理盐水维持脑部湿润。

(6)在腹侧颈部的开口处皮肤下放置一个参比电极(银线)。

缺血去极化

(1)准备一个玻璃微电极，并使该JD为5~10m。用2mol氯化钠溶液灌注电极。

(2)缓缓将微电极伸到该区域(海马DV2.5mm，纹状体DV3.0mm)。

(3)将记录电极和参比电极连接到放大器上，调整直流电源（direct current，DC）电势到0mV。

(4)基础测定1~2min，拉线阻塞双侧颈总，将线结固定在塑料管的凹痕中，如果缺血成功，0~20 mV的DC电势将在2~3min后瞬间下降。

(5)研究海马时，ID测定10min后应放松阻塞的线；研究纹状体时，ID需测定20min。1~2min后DC电势应该回复到0 mV。

(6)移去电极，用手术夹子闭合伤口。

注意事项及常见问题解答

1.注意事项

癫痫是一种脑缺血后常见的并发症。缺血损伤程度和持续时间与癫痫的发病率呈正相关。在Wistar大鼠中，20min缺血可能诱发20%-30%的大鼠癫痫发作。癫痫发作引起的大脑损伤与缺血损伤不同，因此，缺血后癫痫发作的动物必须被找出并剔除实验。判别癫痫的一种方法是观察笼子里的垫料是否被动物溅到笼子外。手术并发症同样值得引起注意，包括脑脊液渗漏等，这将导致减压效应以及额外的组织损伤。

全脑缺血对实验动物损伤很大，同时模型的成功并不是很好的量化。实验期间动物的死亡会影响实验的科学分组与实验的进程，所以要求尽量选择身体状况相同、年龄相近的大鼠作为实验对象，同时要求实验者规范模型制作过程，不可出现偏差。

2.常见问题及解决方法

死亡率

大约10%的大鼠在缺血过程中死亡，或者于再灌注后不久死亡，即使是操作者技术很熟练也会出现这种情况。2~3min阻塞过程中的呼吸衰竭是造成缺血后动物死亡的一个主要原因。立即复苏一般能救活动物。再灌注后大鼠的死亡可能源于严重的脑缺血和脑血栓。此外，脖子和头部的手术创伤会增加死亡率。除 Wistar外的其他品系死亡率可能更高。

死亡率

尽管结果可重复，不同动物的四血管阻塞模型结果可能不同，即使是成功缺血的动物间，两个半球脑损伤程度也不尽相同，实验效果不能完全量化一致。

许多因素影响缺血性结果，包括脑血管侧支循环、脑温、脑葡萄糖水平、麻醉、氧分压和二氧化碳分压等。重要的是要严格控制变量和优化实验条件，有助于获得稳定一致的结果。

*以上内容部分源自《实验卒中模型方法学》

书号：ISBN 978-7-313-21776-9

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