线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书

线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书

测定意义

测定原理

需自备的仪器和用品

试剂组成和配制

试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5mL×1支，-20℃保存；试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；试剂七：液体2.5mL×1瓶，4℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做）。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅱ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前把试剂五和试剂六转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）在1mL玻璃比色皿中加入40μL样本、100μL试剂七和800μL工作液，立即混匀，记录605nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

复合体Ⅱ活力单位的计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=559×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=113×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。复合体Ⅱ活力(U/104cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.226×ΔAV反总：反应体系总体积，9.4×10-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

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