pUC-T TA快速连接试剂盒（含载体，连接酶）说明书

pUC-TQuickLigationKit

pUC-TTA快速连接试剂盒（含载体，连接酶）

目录号：YJ2591

保存条件：-20℃保存。

组分说明

Cat.No.YJ2591

Size20次

pUC-T（50ng/μl）20μl

ConctrolInsert(50ng/μl)10μl

QuickT4DNALigase20μl

2×QuickLigationReactionBuffer120μl

本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途

产品简介

　　pUC-TTA载体是一种GX克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoRV

酶切位点处切开，在两侧的3′端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR

产物的3′端添加一个A，它可以与pUC-T3′端的T互补连接，因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。

　试剂盒中配备GX率的T4DNALigase和为快速GXDNA连接优化的2×QuickLigation

ReactionBuffer。连接效率相当于用T4DNALigase进行常规连接1小时。带有插入片

段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克

隆后可以用BcaBESTSequencingPrimers和M13通用引物对PCR产物进行测序。

注意事项

1．InsertDNA要求

1）连接使用的PCR片段3’末端应带有“A"尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。

2）PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片

段或残存引物等杂质影响。推荐使用YJ2302/YJ0524/YJ0518快速琼脂糖凝胶

DNA回收试剂盒。

2．连接反应要求

1）本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，

增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降

低；如25℃快速连接反应过液夜，则转化效率会下降到75%。

2）2×QuickLigationReactionBuffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混

匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。

3）由于T4DNALigase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将

液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。

4）如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议

使用离心柱将连接产物进行DNA纯化（如YJ2301快速DNA产物纯化试剂盒）后再

进行电转。

3．感受态细胞要求

建议使用GX的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需

进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型（F′编码的【lacZΔM15】）产生ω片

段，才能与载体DNA产生的LacZα多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α互补）。

pUC-TTA载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司YJ0807T*P10感受态细胞、YJ0808DH5α感受态细胞。

4．阳性克隆筛选

阳性DNA片段成功插入至pUC-TVector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受

到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白

色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的

读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

5．阳性对照

为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配

备的ControlInsert（750bp）进行阳性对照实验。

使用方法

1．按以下体系配制反应液：

成分反应体系对照体系

pUC-T1μl1μl

DNA插入片段*0.1-0.3pmol--

ControlInsertDNA--1μl

2×QuickLigationReactionBuffer5μl5μl

QuickT4DNALigase1μl1μl

RNase-FreeWater补足至10μl补足至10μl

*InsertDNA的使用量：在进行克隆时，VectorDNA和InsertDNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，

可根据实验情况选择适当的VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比。InsertDNA的使用量=nmol数×660×InsertDNAbp数。本载体1ml（50ng）的摩尔数约为0.03pmol。

2．轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。

注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。

3．反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接

产物置于-20℃保存。

注意：勿进行加热失活反应。

4．将连接产物加入50μl感受态细胞中（将感受态细胞置于冰上融化），冰浴30分钟。

注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。

5．42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

6．加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150rpm振荡培养45分钟，

使菌体复苏。

7．根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体

培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，

倒置培养，37℃培养12-16小时。

8．计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。

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