western blot实验中的常见问题与解决方案

目标条带信号不强或者没有

1，发光液灵敏度不够

推荐使用本公司发光液，超高灵敏，超低背景，支持长时间曝光，可检测低至15飞克抗原，支持室温保存。灵敏性超越Pierce,Millipore最 高 端产品4到16倍

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2，二抗活性丧失

推荐本公司羊抗兔，羊抗鼠及兔鼠通用无背景二抗，可使用本公司双功能预染marker的25kd质控二抗活性。

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3，曝光时间不够

增加曝光时间，并使用本公司超敏发光液，因为很多同类产品发光性能随时间迅速衰减，客户可测试我们的发光液发光4个小时候后信号仍无衰减。

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4，一二抗反应时间不充分

一般一抗过夜，二抗2小时，推荐使用本公司快速封闭及抗体稀释液，可加速反应过程，并保持抗体长时间抚育过程中的活性。

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5，一抗失活或者本身亲和力不足

推荐重新购买抗体或者选择本公司500元小量抗体快速制备服务

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6，转膜有问题，抗原穿膜或者仍在胶上未转移

推荐本公司预制胶和电泳转膜通用缓冲液，1个半小时仅使用一种缓冲液完成电泳转膜全部工作，100%实现转膜，并且无需冰浴和甲醇。

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7，样品浓度太低或严重降解

推荐使用本公司抗干扰5分钟定量或BCA检测试剂进行快速定量，使得每条泳道蛋白总量在40ug，如果已有样品确实蛋白含量太低，推荐使用本公司抗降解组织高效裂解液或手持式组织裂解仪重新获得高质量样品。

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8，电泳电极插反，转膜时胶和膜顺序放反，转印膜保护纸没拨开，显影液定影液，X光胶片失效

推荐使用本公司双功能预染marker，利用胶上显色监控电泳和转膜质量，利用25kd信号监控western系统灵敏性和稳定性，利用70kd信号监控一二抗浓度产生的非特异信号。

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Western整个膜比较黑或者比较脏

1，封闭不彻底或者封闭液染菌变质

推荐使用本公司10分钟低背景快速封闭及抗体稀释液，室温操作和保存不变质，只需十分钟封闭即可完成高效封闭，有效保存抗体活性，可回收抗体重复使用

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2，漂洗不彻底或者漂洗液染菌变质

增加快速预漂洗步骤，之后慢速，漂洗三次每次10分钟，或使用本公司高效漂洗液实现高效漂洗和室温不变质

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3，一抗未实现抗原亲和纯化，二抗标记物比例不对或活化位点封闭不彻底

推荐本公司抗原亲和纯化抗体服务，或本公司普通二抗或兔鼠通用二抗，按照固定用量操作即可。

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4，发光液本身不稳定本底高

有些品牌发光液AB液混合不加入酶也会产生本底，推荐使用本公司高稳定超敏发光液。

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杂带非常多

1，主要问题是一抗质量，抗体制备所用抗原尽量要接近单表位，并且抗原纯度要在95%以上，最 后必须抗原亲和纯化。

更换一抗，或接受本公司1400元单表位抗体制备服务，只需要提供蛋白质序列即可实现高特异性抗体。

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2，次要原因是封闭和漂洗不彻底，本地提高后高峰度抗原的杂带信号显示出来

推荐本公司10分钟快速封闭液和高效漂洗液。可一定程度降低此问题。

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Western带型扭曲，模糊，拖带，或斑点

1，聚丙烯酰胺凝胶配置，放置产生质量问题，上样缓冲液和电泳缓冲液变质

推荐本公司高稳定预制胶，可室温存放一年，条带压缩更紧致。新型上样缓冲液，沉降性更好，更高纯度原料，TCEP替代传统还原剂，室温稳定。电泳电转通用缓冲液，室温稳定防变质。

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2，样品不纯含有颗粒物，漂浮物，或者样品中的SDS质量不过关，比例不合适

推荐本公司IP，wb通用裂解液，包含8种抑 制剂防止样品降解。一步法样品除杂质纯化柱，一步离心去除颗粒和漂浮性杂质。新型上样缓冲液使得样品溶解度更高，电泳干扰更小。

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3，转膜过程产生的发热，缓冲能力，气泡共同形成不稳定

推荐本公司电泳转膜通用缓冲液，高稳定防变质，电泳后直接湿转或半干转，不需冰浴不需甲醇，一个半小时完成电泳到电转全部过程。另外推荐预切NC，pvdf膜，预切厚滤纸，高效除气泡工具，防污染曝光夹膜，四产品一体组合套装，简化操作，杜绝气泡，保证转膜电场的均匀。

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